胞外ATP对壳聚糖诱导的ROS和PAL活性变化的影响

杨德丽 王娟娟 庞海龙 孙 坤 冯汉青

（西北师范大学生命科学学院，兰州 730070）

壳聚糖（chitosan，CTS）是一种天然的高分子聚合物，具有无毒、抑菌、生物相容及生物降解等多种优良特性［1］。研究表明，壳聚糖可作为植物的生长调节剂，促进植物种子的萌发、根的伸长和幼苗的生长发育［1］。此外，也有许多研究结果表明，壳聚糖还可诱导植物胁迫抗性的提高，有利于植物抵抗各种真菌、细菌、昆虫等生物胁迫以及盐、干旱、重金属等非生物胁迫［1，2～5］。

大量研究表明，在壳聚糖调节植物生长及激活植物抗性反应过程中通常会激发两种植物细胞的生理学反应：①壳聚糖可诱导植物细胞活性氧（ROS）的产生［6～8］；ROS 作为植物体内一类重要信号分子，可参与调节植物的生长发育和逆境胁迫响应；同时也可直接作用于各种病原微生物抑制其生长［9］。②壳聚糖可激活植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［8，10］；PAL 是苯丙烷途径的关键酶和限速酶，广泛参与植物生长发育的多种生理活动［11］，其通过提高木质素的合成从而参与了植物生长发育和抵御病原微生物；此外，PAL 参与合成植物花青素和黄酮等物质的产生，从而提高了植物抵御生物和非生物胁迫的能力［12～13］。因此，ROS水平和PAL 活性变化被认为是壳聚糖所引起的植物标志性生理学响应。

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是生物体内重要的分子，参与多种代谢反应。传统观念认为ATP 主要在细胞内部发挥功能，作为能量分子参与细胞的代谢活动。但近年来的研究表明，细胞内部的部分ATP 可通过ABC 转运载体蛋白、阴离子通道或膜泡运输的方式被转运到胞外，从而形成了胞外ATP（extracellular ATP，eATP）［14］。Choi 等［15］在拟南芥中发现了第一个胞外ATP 受体DORN1，为阐明植物细胞胞外ATP 信号传导过程奠定了基础。和细胞内部的生理学角色不同，胞外ATP 主要作为一种重要的信号分子，在植物生长发育和细胞基础代谢中发挥重要功能，并且参与植物细胞对重金属胁迫、渗透胁迫、机械刺激等多种胁迫的响应［16～21］。

大量研究表明，胞外ATP 水平对于植物细胞的活性氧水平具有明显的调节作用［16～17，20］。尽管没有对PAL 的生理学活性进行测量，但Wu［22］等的研究表明胞外ATP 的水平对植物PAL 编码基因具有调节作用。上述研究表明，植物ROS 和PAL 受到了胞外ATP 水平的调节。而如上所述，ROS 水平和PAL 活性变化是壳聚糖所激发的典型的植物细胞生理学反应，但胞外ATP 对壳聚糖诱导的这些生理学变化是否具有影响在国内外尚无报道。基于此，本实验以烟草悬浮细胞为材料，初步探讨了胞外ATP对壳聚糖引起细胞ROS水平和PAL活性变化的影响，以期能够进一步了解胞外ATP 的生理学作用，也为壳聚糖诱导的植物生理学变化的调控机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

烟草悬浮细胞（Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2）由姜里文教授（中国香港大学）馈赠。使用添加了质量分数为3%蔗糖和0.4 mg·mL-12，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的MS（Murashige-Skoog）液体培养基在25℃、130 r·min-1黑暗条件下振荡培养。实验中使用继代培养至对数期的悬浮细胞，所有步骤均在无菌条件下完成。壳聚糖购自北京索莱宝科技有限公司，来源于虾蟹壳，脱乙酰度约为90%。使用1%的乙酸溶解，放于60℃至完全溶解，用1 mol·L-1NaOH 调pH 至5.7，之后用无菌水定容，高压灭菌后备用［23］。

1.2 烟草悬浮细胞的处理

取一定体积继代培养至对数期的烟草悬浮细胞，进行以下处理：①在烟草悬浮细胞中加入终浓度为5、10、15、20µg·mL-1壳聚糖；②在烟草悬浮细胞中加入终浓度为10、20、30、40 µmol·L-1ATP；③在烟草悬浮细胞中分别加入20 µmol·L-1ATP、20 µmol·L-1ATP+10 µg·mL-1的壳聚糖溶液或10µg·mL-1的壳聚糖溶液，对照中加入等体积的无菌水。在25℃黑暗条件下振荡孵育30 min 后，进行各项指标的检测。

1.3 细胞内ROS水平的测定

参照NavdeepKaur 等［24］报道的方法。取待测的细胞悬浮液475 µL，加入25 µL H2DCFDA（2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate），黑暗孵育5 min，继而加入800 µL 磷酸缓冲液，离心3 min（3 000 r·min-1），弃上清液，将样品置于荧光显微镜下（Leica，DM5000 B，Wetzlar，德国）进行成像观察（20×），并采用Image J软件分析细胞内ROS荧光强度。

1.4 细胞PAL活性的测定

参照王敬文等［25］改进的方法。取烟草细胞，每0.2 g 细 胞 加 入1 mL 预 冷 的0.05 mol·L-1pH 为8.8 的硼酸缓冲液（含5 mmol·L-1巯基乙醇）和0.02 g聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨成浆，在4℃，10 000 r·min-1下离心15 min，抽取上清液为酶提取液。检测液组成为0.5 mL 酶提取液、2.5 mL pH8.8 硼酸缓冲液、1 mL 0.02 mol·L-1L-苯丙氨酸（用0.1 mol·L-1pH8.8 硼酸缓冲液配制）和1 mL 蒸馏水，总体积为5 mL。反应液置于30℃水浴中，反应30 min 后加6 mol·L-1HCl 0.1 mL 终 止 反 应。在290 nm 下 测OD 值，以每分钟每毫升酶液OD 值变化0.01 为1个酶活性单位。

1.5 细胞eATP水平的测定

取待测悬浮细胞加入1 mL 离心管中，离心4 min（4℃，4 000 r·min-1），吸取上清，每100µL 待测样品加入100µL 萤火虫尾部提取物溶液，迅速混匀，测定其荧光强度，根据测定荧光的强弱，得出相应ATP的浓度［26］。

1.6 数据分析

使用Microsoft office Excel 2010 进行数据整理，实验结果均用平均值±标准差表示，使用Ori⁃gin 9.0 软件对数据进行双总体t检验，在P<0.05 上有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖和外源ATP 对细胞内ROS 水平和PAL活性的影响

随着壳聚糖（CTS）浓度的升高，细胞内ROS的荧光强度逐渐升高（见图1：a～e，图2）。且均显著高于CK，其中5 µg·mL-1壳聚糖处理使细胞内的ROS荧光强度约为CK的1.4倍，而10、15和20µg·mL-1壳聚糖处理使细胞内ROS 水平进一步增加，分别增至CK 的3.4、4.6 和6.4 倍。使用5～15µg·mL-1壳聚糖处理，使细胞内PAL 活性显著增加，且均显著高于CK，其中15 µg·mL-1壳聚糖处理下PAL 活性最高，为CK 的1.4 倍（见图3）；当壳聚糖浓度达到20µg·mL-1，PAL 活性有所下降，但仍然高于对照。不同浓度外源ATP 处理下，细胞内ROS 的荧光强度和PAL 活性均无显著变化（见图1：f～j、图4～5），选择20µmol·L-1的外源ATP进行后续实验。

2.2 壳聚糖对细胞胞外ATP水平的影响

不同浓度的壳聚糖处理下，胞外ATP 水平均显著低于CK（见图6）。5 和10 µg·mL-1壳聚糖处理下，胞外ATP 水平分别降低至CK 的0.7 和0.4倍；15µg·mL-1壳聚糖处理下胞外ATP水平降低为CK 的0.09 倍。在20 µg·mL-1壳聚糖处理下，胞外ATP 水平有一个回升，但仍然显著低于CK，约为CK的0.3倍。

2.3 外源ATP 对壳聚糖诱导下细胞内ROS 和PAL活性的影响

本研究选择在10 µg·mL-1壳聚糖处理浓度下探究外源ATP对壳聚糖诱导的ROS水平和PAL活性变化的影响。在用10 µg·mL-1壳聚糖处理30 min 后，细胞内ROS 水平急剧升高约为CK 的2.8倍。单独用20µmol·L-1的外源ATP 处理未引起细胞内ROS 水平的显著变化。而在10µg·mL-1壳聚糖处理的细胞中加入20µmol·L-1的外源ATP 则使细胞内ROS 水平显著降低，约降为壳聚糖处理细胞的0.6倍（见图1：k～n，图7）。

用10 µg·mL-1壳聚糖处理使得细胞PAL 活性显著升高。单独用20µmol·L-1的外源ATP 处理使得细胞PAL 活性有轻微上升，但未达到显著水平。而较之壳聚糖处理的细胞，在10µg·mL-1壳聚糖处理下加入20µmol·L-1的外源ATP 使PAL 活性显著降低，约壳聚糖处理的细胞的0.8倍（见图8）。

3 讨论

活性氧（ROS）可以作为信号分子调控植物生长发育并参与激活防御反应。已有研究表明，蛋白或寡糖等激发子均可诱导烟草ROS 的释放［27～28］。本研究发现，在用壳聚糖诱导处理烟草悬浮细胞30 min 后细胞内ROS 便显著升高，并且诱导ROS水平的高低与其浓度密切相关。苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物生长、次生代谢物合成及抗逆过程中有重要作用［13～14］。试验发现，壳聚糖诱导处理后烟草悬浮细胞PAL 活性先随壳聚糖浓度的增加而升高，在15µg·mL-1壳聚糖处理下PAL活性达到峰值，此后在20 µg·mL-1壳聚糖处理下PAL 活性有所下降，但仍然高于对照。不同浓度外源ATP处理下未引起ROS水平和PAL活性的显著变化。而和ROS 水平和PAL 活性变化不同的是，壳聚糖处理下烟草悬浮细胞胞外ATP 含量显著下降。

Amborabe∙［29］等研究发现壳聚糖的作用部位主要位于细胞质膜，其能够激活植物细胞质膜H+-ATP 酶的活性，促进生物膜去极化并诱导一系列相关事件的发生。因此，壳聚糖可能通过激活植物细胞质膜ATP 酶活性，进而促进胞内ATP 水解，ATP 通过转运载体蛋白或者胞吐等作用从胞内释放到胞外的ATP 量减少，同时作为次级代谢信号分子，质子跨膜流动也会引起ROS 水平升高并伴随防御基因的表达及抗性相关酶PAL 活性的升高。因此，我们认为胞外ATP 水平的降低可能是壳聚糖诱导植物早期反应的关键条件之一。

为了进一步判断胞外ATP 对壳聚糖诱导的ROS 和PAL 活性变化是否具有影响，我们在10µg·mL-1的壳聚糖处理的烟草悬浮细胞中比较了外源施加ATP和未施加ATP后ROS含量和PAL活性的不同。结果显示，在壳聚糖处理的烟草悬浮细胞中施加20µmol·L-1外源ATP 可显著降低壳聚糖引起的ROS水平和PAL 活性的升高，这提示，胞外ATP水平可负向调节壳聚糖引起的ROS水平和PAL活性的升高。

研究表明，外源ATP 处理可引起作物的抗氧化酶活性显著增强，从而减少ROS的积累［30-31］。此外，Chivasa 等［32］发现，用800 µmol·L-1的外源ATP处理烟草叶片导致了超氧化物歧化酶蛋白含量的显著性上升。我们实验室之前的工作也发现，外源ATP能够减少铅胁迫下烟草悬浮细胞ROS的上升，并显著上调植物的抗氧化酶活性［33］。因此，胞外ATP 可能通过提高植物的抗氧化酶活性而减少壳聚糖引起的ROS的升高。Wu等［22］发现，对伤处理的番茄叶片施加细胞外ATP 水解酶（降低了细胞外ATP 水平）导致了PAL 编码基因表达量的上升，提示胞外ATP 负向调节PAL 编码基因的表达。因此，推测在壳聚糖引起的PAL 活性升高过程中胞外ATP 水平可能通过影响PAL 编码基因的表达而负向调节了PAL活性。

以上研究表明，胞外ATP 水平至少可负向调节壳聚糖引起的ROS水平和PAL活性的升高。尽管胞外ATP 对壳聚糖所引起的这些生理学变化的负向调控的意义尚不清楚。但有部分研究发现，人为增加植物细胞胞外ATP 水平会降低植物对病毒和细菌的抗性；而降低植物细胞胞外ATP 水平会增加植物对病毒和细菌的抗性［34～35］。另有研究发现，减低植物的胞外ATP 水平会增加植物对低温的耐受［36］。

这些工作提示，在某种环境下植物需要降低胞外ATP 水平以增强自身的抗性反应。因此，壳聚糖处理下烟草悬浮细胞胞外ATP 含量下降可能是植物细胞加强ROS 水平和PAL 活性所需要的，从而增强了壳聚糖的生理学效应。其具体机制尚待进一步揭示。