应用MAS技术改良水稻特异种质大粒溪香的稻瘟病抗性

宋 泽， 余显权， 黎小冰， 陈惠查， 阮仁超, 王玲莉， 宋 伦

(1.贵州省农业科学院农作物品种资源研究所， 贵阳 550006；2.贵州大学农学院， 贵阳 550025； 3.贵州省农业科学院园艺研究所， 贵阳 550006;4.安顺职业技术学院， 贵州 安顺 561000)

稻瘟病是世界范围内危害水稻生产最严重的真菌性病害之一，可发生在任何稻作区，在高温高湿雨季较长的区域，极易大面积爆发，如不及时进行有效防治，会导致水稻产量大幅度降低甚至绝收[1]。传统防治方法是利用化学药剂控制其发生，而化学药剂防治不仅使生产成本增加，而且药剂残留也会对人畜和环境造成不同程度毒害和污染[2]。培育抗性品种成为控制病害最为经济有效的途径，但传统的抗病育种依靠表型来进行选择，易受外界环境条件影响而选择效率不高，且育种周期较长[3]。由于稻瘟病菌生理小种遗传较为复杂，抗病品种在推广种植数年内就逐渐丧失抗性。育种实践证明，以获得的抗性基因能够培育出对稻瘟病具有持久抗性的水稻新品种。利用分子标记辅助选择(MAS)分析与目标基因紧密连锁的分子标记对选择个体进行目标区域及全基因组的筛选，能够快速提高抗病基因的转育选择，加快进程、提高效率，已被广泛应用于水稻育种实践[4-7]。

“大粒溪香”是贵州大学农学院以贵州省农业科学院水稻研究所创制的水稻特异种质“大粒香”为亲本材料，以改良其抗病性和产量为育种目标所培育出的品质好、产量高、香味浓的水稻新品系，其综合抗病性较“大粒香”得到一定程度的提升，更显现出叶瘟抗性增强，而对穗颈瘟的抗性改良效果不突出。为此，本研究利用分子标记辅助选择技术，以携带Pi1和Pi9抗病基因且农艺性状表现与大粒溪香相近的BC4F2群体为材料，通过异地加代完成了BC5F5株系的构建，并对其进行苗瘟接种鉴定及不同生态环境的田间自然鉴定，全面评价大粒溪香改良株系在不同生态区的抗性水平，以期创制出保持大粒溪香优良特性的新品系，为水稻优质、高产、抗病育种和种质创新利用提供实践参考和新种质。

1 材料与方法

1.1 材 料

以大粒溪香为感病受体亲本(感病对照)、金23 B为抗病供体亲本，获得携带Pi1和Pi9抗病基因的BC4F2群体为基础材料，并通过加代构建BC5F5株系，均由贵州大学农学院提供。

用于接种的稻瘟病菌株系贵州省主要稻区征集而来，包含了ZA～ZG 5群的11个单孢分离菌株(08-108-1，08-48-2，08-234-2，08-232-2，08-100-1，08-41-1，08-229-1，08-31-2，07-46-1，07-99-1，07-52-1)，由贵州省农科院植物保护研究所提供。

1.2 分子标记选择

本研究利用已报道与抗性基因Pi1紧密连锁的SSR标记RM 224(F：5′-ATCGATCGATCTTCACG

AGG-3′；R：5′-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3′)，根据抗性基因Pi9的内部碱基序列开发的STS标记pB 8(F：5′-CCGGACTAAGTACTGGCTTCGATA-3′；R：5′-CCCAATCTCCAATGACCCATAAC-3′)，对供试材料进行检测，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 DNA提取和PCR反应

采用CTAB法提取水稻DNA。PCR反应体系总体积10 μL：模板DNA(30～50 ng/μL)2 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)1.2 μL，dNTP 0.2 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，正、反向引物各1 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反应程序为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，银染后记录结果。

1.4 稻瘟病抗性鉴定

1.4.1苗期接种鉴定

于贵州省农业科学院植物保护研究所温室大棚内进行。将供鉴材料播种于育秧盘(54 cm×28 cm)中，每穴15～20苗，设2个重复，采用随机区组排列。偏施氮肥，待幼苗生长至3～4叶，高压喷雾接种稻瘟病菌混合孢子悬浮液。接种后温室内25 ℃遮阴保湿24 h，高湿培养7～10 d，创造有利的发病条件，充分发病后参照贵州省地方标准调查苗瘟感病情况。

1.4.2田间自然鉴定

选择贵州省稻瘟病常年高发病区的湄潭县抄乐镇和黎平县黎平寨进行叶瘟、穗瘟抗性鉴定。2020年分别播种大粒溪香及改良株系。适时移栽，株行距16.7 cm×20 cm，单本种植，每个材料栽6行，每行10株，2个重复，采用随机区组排列，供鉴材料两边种植高感稻瘟病品种大粒溪香。田间管理措施参照当地生产标准，偏施氮肥，并多次追肥，全生育期保持田间水分充足，未用杀菌剂，水稻分蘖期和成熟后分别进行叶瘟和穗瘟调查，鉴定标准同上。

2 结果与分析

2.1 分子标记辅助选择及株系的筛选

利用双聚合材料金23 B与大粒溪香杂交构建的BC4F2群体，2018年在贵州湄潭抗性鉴定圃回交，然后分别于海南三亚和贵州锦屏自交加代至BC5F5，通过分子标记辅助选择筛选，获得83个含抗性基因的株系(图1)。其中含有Pi1基因株系17个、Pi9基因23个、双基因型株系43个(表1)。

注：Mark为DNA Mark B(100～600 bp)，P1为轮回亲本大粒溪香，P2为聚合材料。 图1 改良株系的筛选 Fig.1 Screening of improved lines

表1 筛选获得不同基因型株系Table 1 Different genotype lines screened in this study

2.2 稻瘟病抗性鉴定

2.2.1改良株系苗瘟抗性接种鉴定

为了评价改良不同基因型株系的苗瘟抗性水平，选用贵州省农业科学院植保所提供含ZA-ZG 5个种群的11个菌株混合孢子悬浮液对其进行苗瘟抗性鉴定。结果表明，感病对照大粒溪香苗瘟病级为7级感病。改良株系的病级在2～6级之间，在含有Pi1基因的株系中，病级为2级的只有1个株系QHX 183，病级表现为2～4级的有11个株系，占该基因型的70.6%；在Pi9基因株系中，病级为2级的有2个株系，表现为2～4级的有20个株系，占该基因型的87.0%；同时含有Pi1和Pi9抗性基因的株系中，病级为2级的有1个株系，病级表现为2～4级的有35个株系，占该基因型的81.4%。改良株系中病级为2～4级，表现为抗、中抗和中感的共有67个株系，占80.7%。表明经过分子标记辅助选择的83个株系相较感病的大粒溪香，其苗瘟抗性水平均有不同程度的提升。

2.2.2改良株系的田间抗性鉴定

2020年将上述83个株系分别于湄潭县抄乐镇和黎平县黎平寨进行稻瘟病田间抗性鉴定，结果见图2和表2。

表2 不同基因型改良株系抗性分布频率Table 2 Resistance distribution frequency of different genetically modified lines

图2 改良株系抗病级别分布Fig.2 Distribution of disease resistance grades of improved lines

在湄潭鉴定圃有55个株系综合抗性指数表现为3级(中抗，下同)，占65.1%。在含有Pi1基因的17个株系中，抗病3级的有11个株系，5级(中感)的有6个株系，分别占64.7%和35.3%；含Pi9基因的23个株系中有15个株系表现为3级，占65.2%；含有双基因的43个株系中有29个达到3级，占67.4%。结果表明，与其原始亲本大粒溪香相比，改良株系的稻瘟病抗性得到有效增强，其中78个株系对稻瘟病具有显著的抗性。

在黎平鉴定圃65个株系综合抗性指数表现为1～3级抗病，占78.3%；表现为5级(中感)的有16个株系，占19.3%；表现为7级(感病)的只有2个株系，占2.4%。在含有Pi1基因的17个株系中抗病表现为3级的有12个株系，占70.6%；含Pi9基因的23个株系中有21个表现为3级，占91.3%；含有双基因的43个株系中有3个株系达1级、29个株系为3级，分别占7.0%和67.4%。综上表明，携带不同抗性基因株系在不同鉴定圃的抗性水平不同，可能缘于不同鉴定圃稻瘟病菌群体结构差异，尤其是其优势生理小种的致病力也不相同所致。

2.2.3不同基因型改良株系两鉴定点平均抗病性评价

亲本大粒溪香在湄潭和黎平病圃鉴定时发病较重，叶瘟病级为8级和7级，穗瘟均为9级高感，其综合抗性指数为8.4，表现为高感稻瘟病。含有抗性基因株系的抗性较对照亲本大粒溪香有了大幅度的提高，改良株系叶瘟病级为1～7级；穗瘟大部分在5～9级，虽然表现为感病，但其穗瘟损失率较低，相较对照大粒溪香的8级穗瘟损失率，降低了3～7个病级。结果表明，含有抗性基因株系的抗性较对照亲本有了明显的提高(图3)。其中有53个改良株系的综合抗性指数为2.48～4.08，表现为中抗稻瘟病；29个株系综合抗性指数为4.10～6.04，综合评价为中抗到中感之间，获得一批可供育种利用的抗病新种质。

图3 大粒溪香及改良株系田间叶瘟及穗瘟感病情况Fig.3 Field leaf blast and ear blast susceptibility of Dalixixiang and improved lines

3 讨论与结论

分子标记辅助选择是利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点，进而检测目标基因是否存在的技术，具有较高的选择效率、选择结果可靠、不易受环境条件干扰等优点[8-9]。防治水稻病害最经济有效的途径是培育抗性品种，既减少生产成本又能降低对环境的污染[10]。李瑶等[11]和Wani等[12]利用分子标记辅助选择在水稻抗病育种方面已取得较大的研究进展。Korachan等[13]通过标记辅助回交(MAB)利用组合的抗稻瘟病QTL(qBl 1，2，11，12)和Saltol QTL进行基因聚合，在BC4F4中筛选出高抗稻瘟病和盐胁迫单株。本研究利用与抗稻瘟病基因Pi1、Pi9紧密连锁的SSR和STS分子标记RM 224、pB 8，对大粒溪香和聚合双基因的金23 B回交后代进行选择，筛选出具有目标基因的后代。在BC5F5共获得83个不同基因型的株系，其中Pi1基因有17个株系、Pi9基因有23个株系、双基因型有43个株系。

因稻瘟病菌有着变异性强、分布范围广和致病性高度分化等特点，具有单个抗性基因的改良水稻只对少数病菌有效，而且携带单个抗性基因的品种一般推广后不久开始面临抗性丧失，无法在生产上继续利用[14]。所以选择两个或多个广谱抗性基因进行聚合育种是非常有必要的。张菊萍等[15]通过MAS技术将Pi1和Pi49两个抗稻瘟病基因导入两系不育系创5 S中，明显提高改良后不育系的抗性，可用来配制抗稻瘟病两系杂交稻组合。本研究中所采用的Pi1和Pi9基因已被大部分研究证实，属于广谱的抗病基因，本课题组前期对携带稻瘟病抗性基因Pi1、Pi9双基因聚合材料，进行了稻瘟病抗性鉴定，结果表明，基因聚合后抗性较大粒溪香有了大幅度的提升，达到中抗水平[10]，这与本研究结果基本一致，表明Pi1和Pi9在株系中能够稳定遗传，具有很高的利用价值。而李耀栋[16]对宁夏582个水稻杂交后代稻瘟病抗性基因进行分子检测，最后结合抗病性、抗稻瘟病基因型和农艺性状综合分析表明，并不是基因数量越多抗性越好，而是不同基因间表现出复杂的互作效应。结合此次鉴定结果可以看出，Pi1、Pi9单基因株系和双聚合株系虽然在苗瘟、叶瘟和穗瘟抗病能力强于对照大粒溪香，但三者间综合抗性指数并无明显差异，而且部分单基因的株系抗性甚至优于聚合株系，可能由于人为选择导致遗传背景存在差异。

生产实践证明，田间抗性鉴定会因当年的气候条件和稻瘟病种群结构改变而发生变化。因此，为做出客观全面评价，应进行多年多点重复试验，以保证鉴定结果的准确性[17-18]。本次试验采用一年两点田间鉴定和室内接种鉴定相结合，大粒溪香均表现为感稻瘟病，此次鉴定结果具有一定的可靠性，但不足之处在于室内鉴定采用的是混合孢子悬浮液进行接种，尚不确定改良株系对不同生理小种的抗性水平，拟在后续研究中明确其抗谱。