暴马丁香成熟胚愈伤组织和体胚诱导及其生理状态解析

彭春雪 崔雪梅 沈海龙

（东北林业大学林学院，林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）

暴马丁香（Syringa reticulata var.mandshurica）是木犀科（Oleaceae）丁香属（Syringa）多年生灌木或小乔木，分布于我国东北、华北和西北等地。暴马丁香花香浓郁，花期长，不仅可以作为城市绿化树种，还可以制作花茶以及提炼精油等［1］。此外，其树干、树皮和枝条中均含有较高的紫丁香苷和橄榄苦苷，具有多种药理活性，可调节免疫力、抗炎、抗菌和降血压等［2～3］。但暴马丁香天然资源数量有限，分布散；而且近年来药厂大量收购暴马丁香树皮，野生资源破坏严重［4］。因此，规模化发展人工资源，已经成为暴马丁香开发利用的重点，而开发适宜的优良种质规模化繁殖技术是人工林资源发展的首要问题。体细胞胚胎发生技术（简称“体胚发生”）是目前被认为最具有潜力的规模化快速繁殖技术，它不仅为植物育种提供新的途径，还可以为遗传转化提供理想材料、为研究植物发育提供理想模型等［5］。

目前，在暴马丁香种子繁殖、扦插和嫁接繁殖、组织培养茎芽发生繁殖等方面已经取得了一些成果［1］，以未成熟胚为外植体的体胚发生体系也成功建立［6］。虽然，暴马丁香再生植株已成功获得，但依然存在一些制约暴马丁香体胚高频发生的问题。前期研究中发现，以未成熟胚为外植体虽获得体胚，但体胚发生过程中伴随外植体褐化现象，且外植体褐化显著影响体胚的发生率［6］。此外，以未成熟胚作为外植体，存在种子易受采集时间限制、不易保存、进行大量研究受限制等问题［7］。这些现象阻碍体胚发生技术规模化应用，且至今尚未得到解决。因此，选择合适的外植体对愈伤组织诱导和体胚发生都至关重要，同时针对愈伤组织诱导和体胚发生过程中的生理变化的研究对了解影响体胚发生的生理响应机制具有重要的意义。

为了进一步建立体胚发生能力与外植体内部的生理生化代谢之间的联系，了解体胚发生的机理。我们以暴马丁香成熟胚为外植体对愈伤组织诱导和体胚发生进行探索，并对愈伤组织和体胚诱导过程中外植体生理变化状态进行测定分析，以期揭示愈伤组织诱导的潜在能力，为进一步建立愈伤组织诱导和体胚发生能力与生化代谢间的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料灭菌

首先，将暴马丁香种子去翅后清洗15 min，蒸馏水浸泡2 d。在超净工作台内用75%酒精浸泡30 s，5%NaClO 浸泡15 min 进行消毒处理，最后用无菌蒸馏水清洗6～7次后备用。

1.2 基础培养基和培养条件

本次研究使用含有70 g·L-1蔗糖，0.4 g·L-1酸水解酪蛋白，6.5 g·L-1琼脂的MS1/2（MS 培养基中所有成分均减半）为基本培养基。在高温高压灭菌之前，将培养基的pH 调至5.8。对所有实验，将培养物保持在（25±2）℃的黑暗条件中。

1.3 愈伤组织和体胚诱导

将灭菌后的种子胚轴端切除2～3 mm，挤出胚，将两片子叶转移至含有不同浓度NAA（0、2、3、4、5、6 mg·mL-1）和BA（0、0.5、1、2、3 mg·mL-1）组合的培养基中进行愈伤组织和体胚诱导。每个培养皿中接种10 个外植体，每个处理重复10 次。在培养过程利用体视显微镜对外植体进行观察，记载外植体变化状态、愈伤组织诱导和体胚发生情况。

1.4 生理指标测定

筛选确定0.5 mg·mL-1BA+5 mg·mL-1NAA 的组合为最佳组合，将外植体接种至含该植物生长剂组合的培养基中进行愈伤组织和体胚诱导，在培养期间对0、3、7、15、30、45和60 d的外植体取样进行生理生化分析。

测定方法：多酚含量根据Sabooni 等人的方法测定［8］；多酚氧化酶（PPO）活性按照Jariteh［9］的方法测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法、参 照Chai 等 的 方 法 测 定［10］；超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD）活性采用氮蓝四唑光化还原法来测定［11］；丙二醛（MDA）含量以脂质过氧化水平方法测定［12］；苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性参照Eldin 等人［13］的方法测定。

1.5 数据分析

培养60 d 后统计愈伤组织诱导率和体胚发生率，公式如下：

试验数据用Microsoft Office Excel 2007进行统计处理，利用SPSS Statistics 19.0 对所有数据进行方差分析，并使用Duncan 多范围检验以5%的概率进行均值比较，最后用Sigmaplot 12.5绘图。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织和体胚的形成

子叶接种3 d 后开始膨大，叶片边缘形成卷曲，7 d 培养后子叶表皮出现白色凸起，继续培养15 d后，可见外植体边缘出现白色透明的愈伤组织（见图1A），30 d后少数外植体的边缘上出现早期体胚，60 d后早期体胚发育成子叶型胚（见图1B）。

2.2 不同生长调节剂对愈伤组织诱导的影响

暴马丁香成熟胚接种于含不同浓度的生长调节剂组合的培养基上均能诱导出愈伤组织，但不同浓度的生长调节剂组合对愈伤组织诱导状况有显著的差异（P＜0.05）。其中，BA 不存在时，依然有愈伤组织的产生，并随着NAA 浓度的升高呈先增加后降低的趋势，在5 mg·mL-1NAA 处理下愈伤组织诱导率最高（78%），在2～3 mg·mL-1NAA 处理下，愈伤组织诱导率最低（34%），与对照组（34%）相比无差异；当NAA 不存在时，2 mg·mL-1BA 处理下，愈伤组织诱导率最高（100%），在1 mg·mL-1BA处理下愈伤组织诱导率最低（68%），与对照组（34%）相比提高50%。在BA 和NAA 同时存在的组合均能诱导愈伤组织，其中3 mg·mL-1BA 和2 mg·mL-1NAA 组合的诱导率最低（60%），但仍高出对照43%，1 mg·mL-1BA 和5 或6 mg·mL-1NAA 的组合愈伤组织诱导率均达100%（见图2）。

2.3 不同生长调节剂对体胚发生的影响

暴马丁香体胚可以从外植体上直接形成，没有经过愈伤组织阶段，但体胚发生率相对较低。不同浓度的生长调节剂组合对暴马丁香体胚发生均有极显著的影响（P＜0.01）。在不加任何生长调节剂或单独添加1种生长调节剂的培养基上，均无体胚发生。在生长调节剂组合为3 mg·mL-1BA+2 mg·mL-1NAA、1 mg·mL-1BA+4 mg·mL-1NAA、2 mg·mL-1BA+4 mg·mL-1NAA、0.5 mg·mL-1BA+5 mg·mL-1NAA 和2 mg·mL-1BA+6 mg·mL-1NAA 的培养基上有体胚形成。其中，在0.5 mg·mL-1BA+5 mg·mL-1NAA 处理组合中体胚发生率最高为8%，其余处理体胚发生率均为2%（见图2）。

2.4 愈伤组织诱导过程中多酚含量和PPO 活性的变化

在暴马丁香愈伤组织诱导过程中，细胞内的多酚含量和PPO 活性发生显著的变化（P＜0.05）。多酚含量在培养过程中呈升—降—升—降趋势，而PPO 活性变化趋势与多酚含量变化趋势完全相反呈降—升—降—升趋势。其中，多酚含量在培养第7 d 时含量最低（0.14%），在第15 d 时达到积累峰值（0.34%）。PPO 活性在培养第3 d 时活性最低（31.66 µ·g-1FW·min-1），在第7 d 时PPO 活性达到积累高峰（175.66µ·g-1FW·min-1）。随着培养时间延长，PPO 活性呈下降趋势，在培养至30 d 下降至33.1µ·g-1FW·min-1，随后继续升高（见图3）。

2.5 愈伤组织诱导过程中抗氧化酶（SOD 和POD）活性的变化

在暴马丁香愈伤组织诱导过程中，细胞内SOD 活性发生显著变化（P＜0.05）。SOD 活性随着培养时间的延长呈降—升—降趋势，在培养0～3 d 时外植体细胞内的SOD 活性急剧下降，在第3 d 时SOD 活性降至最低为988.89 µ·g-1FW。随后SOD 活性逐渐上升，培养15 d 时SOD 活性达到峰值（1 618µ·g-1FW），随着培养时间的延长，SOD活性又开始下降。此外，外植体在诱导过程中的POD 活性随培养时间的延长呈直线上升，在培养初期，POD 活性最低，为1 126.6 µ·g-1FW·min-1。当培养至60 d时，POD 活性相较于0 d时的POD 活性增加了90倍（见图4）。

2.6 愈伤组织诱导过程中MDA 含量和PAL 活性的变化

在暴马丁香愈伤组织诱导过程中，MDA 活性随着培养时间的延长发生显著变化（P＜0.05）。在外植体培养过程中，细胞内MDA含量均低于0 d（27.41µ·g-1FW）。其中，在培养7 d 时，外植体细胞内MDA 活性最高（23 µ·g-1FW），与0 d 相比下降了16%；在培养30 d 时，MDA 含量最低（10.14µ·g-1FW），与0 d相比下降了63%（见图4）。此外，在培养过程中，外植体细胞内PAL 活性也发生显著变化（P＜0.05），培养3 d（3 460.85µ·g-1FW·h-1）时细胞内PAL 活性最低，培养至60 d 时细胞内PAL 活性积累达到峰值，相较于0 d（4 514.55µ·g-1FW·h-1）细胞内PAL活性提高了52%（见图4）。

3 讨论

3.1 不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导和体胚发生的影响

体外培养条件中，细胞分裂素和生长素对植物组织或者器官的愈伤组织诱导反应起到至关重要的作用，通过控制生长素与细胞分裂素的比例进行愈伤组织诱导已经在很多植物中获得了成功，但不同植物或同种植物不同器官所需的植物生长调节剂物质种类也大不相同［14］。在本研究中，以暴马丁香成熟胚为外植体，在0.5 mg·mL-1BA 和0～6 mg·mL-1NAA 处理组合下愈伤组织诱导率高达90%以上，而在刘春苹等研究中［7］，以暴马丁香未成熟胚为外植体，在0.5 mg·mL-1BA 和1.5 mg·mL-1NAA处理组合中，获得最大愈伤组织诱导率（84%）。我们发现，相较于未成熟胚，成熟胚具有更高的愈伤组织诱导率。同时，在成熟胚研究中发现通过愈伤组织的间接体胚发生诱导率为0%，而在未成熟胚研究中，通过愈伤组织的间接体胚发生诱导率为24%［7］，这表明成熟胚作为外植体虽获得较高的愈伤组织诱导率，但这些愈伤组织无体胚发生能力，其原因可能是外植体暴露于高水平生长调节剂环境中，细胞可能仅仅是模拟胚胎发生的细胞行为，并未真正转化为胚胎发生细胞，无法进一步形成体胚［15］。此外，在我们的研究中发现以成熟胚为外植体，在0.5 mg·mL-1BA 和5 mg·mL-1NAA 处理组合中获得最高体胚诱导率（8%），其中体胚发生形式均为直接发生。而未成熟胚研究中，在0.5 mg·mL-1BA 和0 mg·mL-1NAA处理组合中，以直接体胚发生形式的体胚诱导率为36%。相较于成熟胚，未成熟胚作为外植体无论是直接体胚发生还是间接体胚发生均更容易获得体胚。在番木瓜［16］和长白落叶松［17～18］研究中也出现类似结果。同时，在未成熟胚中诱导愈伤组织只需要较低浓度的NAA［7］，但在成熟胚中则需要较高浓度的NAA，这表明愈伤组织诱导受到外植体的生长发育状态的显著影响。植物幼嫩、生长旺盛的部位生长素类激素水平较高，只需要较低浓度的外源激素。而植物发育成熟且分化程度较高的部位，内源激素较低，脱分化困难，因此需要补充较高浓度的外源激素［19］。有趣的是，对于高百分比的愈伤组织诱导，本研究发现NAA 的添加并没有起到主导作用。与之相反，BA 对于愈伤组织诱导却是必需的且比NAA更有效。这在红景天愈伤组织诱导研究中也得到类似报道［4］。在单独添加BA 或者NAA 与BA 的处理组合中，有助于愈伤组织形成。有研究指出，BA 对诱导具有优越性，可能是因为植物组织比人工生长调节剂具有更容易代谢天然激素的能力，也可能是因为BA 激发植物组织产生天然玉米素等其他激素的能力［20］。

3.2 愈伤组织诱导和体胚发生过程中外植体的生理变化

本研究中多酚含量在愈伤组织形成初期急剧上升，随着培养时间的延长缓慢下降，但仍然保持较高水平。在以往的研究中，酚类物质通常被视为体外繁殖的有害化合物［21］，但近年来越来越多的研究表明酚具有促进体外形态发生的能力，在根的形成以及枝条增殖中均具有促进作用［22］。在咖啡愈伤组织研究中，观察到愈伤组织仅发生在褐变的外植体上［23］。众所周知，愈伤组织细胞是高代谢和活跃分裂的细胞，一旦形成愈伤组织，就会继续增殖，而愈伤组织增殖则需要生长素［24］。Eldin 等研究指出，许多酚类化合物可能通过酶促反应提高或者降低吲哚乙酸（IAA）的含量进行生理调节［13］，这就解释了暴马丁香在愈伤组织形成初期具有较高水平多酚含量的现象。除此之外，本研究中发现，在暴马丁香子叶型胚发生阶段，PAL 活性急剧升高，这与Khan 等在水飞蓟素体胚研究结果类似［25］。有研究指出，PAL 参与的代谢途径产生的酚酸化合物一部分可以充当木质素生物合成的前体，一部分则具有生长素保护剂的功能［26］。这些研究表明体外培养过程中体胚诱导和酚类化合物的产生并不矛盾，其中的某些酚类化合物可能参与木质素的合成，这在体胚发生过程中是极其重要的。在体胚诱导过程，本研究发现POD 活性逐渐增加，在子叶型胚时期达到峰值，相比之下，SOD 活性体胚发生期间略有下降。这与Blazquez 等在藏红花体胚发生研究中的结果类似［27］。已有研究证明，POD 和CAT 在生长分化中起到至关重要的作用，其高活性可能与植物芽和根的分化过程相关。同时，Corfeeener 等提出POD活性不仅在体胚发生过程中起到维持细胞的大小和形状的作用，而且在木质素形成过程中也可能起到维持细胞壁形成的重要作用［28］。此外，研究结果表明暴马丁香在愈伤组织形成初期SOD 活性有所上升。在夏凯莉的研究中发现黑莓胚性愈伤组织中的SOD 活性显著高于非胚性愈伤组织［29］，这表明在愈伤组织形成初期需要大量的能量，从而导致产生高的线粒体活性以及过氧化物。因此，通过对POD 和SOD 活性变化的观测可以对体外培养过程的形态变化提供理论依据。

综上所述，我们得出在0.5 mg·mL-1BA 和0～6 mg·mL-1NAA 处理组合下愈伤组织诱导率高达90%以上，在0.5 mg·mL-1BA 和5mg·mL-1NAA 处理组合中获得最高体胚诱导率（8%），其中，体胚发生形式均为直接发生。而在高百分比的愈伤组织诱导中，发现NAA的添加并没有起到主导作用，相反BA 对于愈伤组织诱导却是必需的且比NAA更有效。此外，在生理研究中多酚含量在愈伤组织形成初期急剧上升，随着培养时间的延长缓慢下降，但依旧保持较高水平；POD 活性逐渐增加，在子叶型胚时期达到峰值；相比之下，SOD 活性体胚发生期间略有下降。这表明外植体中适量的多酚含量积累和较高POD 活性有利于愈伤组织诱导和体胚发生。因此，在未来的研究中，需要进一步探究活性多酚和氧代谢与愈伤组织诱导和体胚发生之间的调控机理。