人二倍体细胞在人用狂犬病疫苗中应用的研究进展

石磊泰 综述，李玉华 审校

中国食品药品检定研究院，北京102629

20 世纪60 年代，人们使用人二倍体细胞（human diploid cell，HDC）生产病毒性疫苗，如口服脊髓灰质炎疫苗，该疫苗及其他病毒性疫苗已成功免疫数十亿儿童，免疫结果表明，采用HDC 生产的疫苗安全有效［1］。狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的以中枢神经系统症状为主的一种动物源性传染病，病死率几乎100%。全球每年狂犬病死亡例数约60 000 例，主要发生在亚洲和非洲，我国为狂犬病流行国家［2-3］。疫苗是预防狂犬病最主要的手段，目前，人用狂犬病疫苗使用的细胞基质包括鼠脑、猴肾细胞、原代地鼠肾细胞和HDC［4］，其中HDC 由于具有无致癌性、无外源因子污染、细胞性状较稳定等特点，成为WHO 认可的更安全的疫苗生产用细胞，广泛应用于人用疫苗的研发与生产中。本文就HDC 在人用狂犬病疫苗中应用的研究进展作一综述。

1 HDC 的特性及建株背景

2010 年，WHO 提议以HDC 替代原代猴肾细胞用于生产脊髓灰质炎病毒疫苗及其他病毒疫苗。与原代猴肾细胞比较，HDC 低温保存时可保持较低的群体倍增水平，并可建立冷冻保存的细胞库，日后可扩展为数十年的标准化细胞来源，且不含外源因子，接种免疫缺陷动物后不形成肿瘤［1］。

HDC 作为病毒性疫苗生产的主要细胞基质之一，20 世纪60 年代，美国Wistar 研究所进行了一系列人胚胎二倍体细胞建株培养工作，HAVFLICK等［5］从正常胚胎（妊娠3 个月）肺组织中提取并建立了Wistar Institute-38（WI-38）人二倍体细胞系［6］；JACOBS 等［7］于 1966 年 9 月从 1 名 14 周男性胎儿的正常肺组织中提取并建立了Medical Research Council-5（MRC-5）细胞株［8］。中国医学科学院生物学研究所于1973 年建立了人二倍体细胞株KMB17，取材于4 月龄女胎的肺组织，体外培养9 个月，该细胞株至少对71 种病毒敏感且不具致癌性［9］。目前，KMB17 细胞已成功应用于脊髓灰质炎减毒活疫苗、甲型肝炎减毒活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗及肠道病毒71 型灭活疫苗的制备及研究［10-12］。2BS 细胞是北京生物制品研究所于1973 年分离建株，细胞取自3 月龄女胎的肺组织［13］。目前，2BS 株细胞主要应用于水痘减毒活疫苗的研究及生产［14］。

2015 年，MA 等［15］从 1 名 3 个月胎儿的肺组织中提取了一种新的HDC 并建株，命名为Walvax-2。在Walvax-2 和 MRC-5 细胞繁殖过程中发现，二者生长速度、细胞活力和病毒敏感性方面存在差异，Walvax-2 细胞复制更快，48 h 的融合度与MRC-5 细胞培养72 h 的融合度相同；另外，Walvax-2 细胞在上述时间内获得了58 次细胞倍增，MRC-5 细胞达48 次传代；Walvax-2 细胞培养病毒的滴度与MRC-5细胞相当或优于MRC-5 细胞。

2 HDC 在人用狂犬病疫苗中的应用

美国 Wistar 研究所 WIKTOR 等［16］于 1962 年开始用狂犬病固定毒巴斯德PM-1503 3M 株在HDC的WI-38 株上适应传代，1965 年将第52 代适应株制备成生产用主毒种。1966 年将该主毒种转让给法国Merieux 研究所，1969 年转让给德国Behring 厂，1971 年转让给美国Wyeth 厂。法国 Merieux 研究所早期使用WI-38 细胞生产狂犬病疫苗，随后进行了人二倍体细胞疫苗（human diploid cell vaccine，HDCV）的开发研究，改用MRC-5 细胞培养狂犬病病毒，经β-丙内脂灭活，浓缩后制备成冻干疫苗，于1974年在法国首次获得生产许可证，1978 年开始进行商业生产和应用。由于纯化的HDCV 接种后尚存在轻微的局部不良反应，德国Behring 厂后续开发了蔗糖梯度区带离心的浓缩纯化疫苗，并经β-丙内脂灭活，于1978 年获生产许可证，接种后不良反应率有所下降。Wyeth 厂仍采用WI-38 细胞培养狂犬病病毒，经磷酸丁三脂灭活病毒，过滤浓缩后制备疫苗［17-18］。

1980 年，法国赛诺菲巴斯德公司生产的HDC狂犬病疫苗（Imovax®）在美国获批使用，该狂犬病疫苗是一种无菌、稳定、冷冻干燥的狂犬病病毒悬浮液，由宾夕法尼亚州费城Wistar 研究所获得的毒株PM-1503-3M 经MRC-5 细胞培养，通过超滤浓缩及β-丙内酯灭活制备而成，每剂疫苗（1.0 mL）含有少于100 mg的人白蛋白、150 μg 硫酸新霉素和 20 μg 酚红指示剂，灭活剂β-丙内酯含量少于0.000 05%，效力高于2.5 个国际单位的狂犬病病毒抗原［19］。HDC 狂犬病疫苗（Imovax®）上市后（1990 — 2015 年）不良反应监测结果显示，共报告1 611 例不良反应，其中最常见的3 种不良反应包括发热（18.2%）、头痛（17.9%）和恶心（16.5%），大部分不良反应较轻，均为注射局部反应、超敏反应和非特异性体质症状；93 例（5.8%）严重病例，其中4 例死亡与疫苗接种无关［20］。

国内采用微载体生物反应器成功实现了HDCV的规模化生产。2014 年，国产的人用狂犬病疫苗（MRC-5 细胞）在国内获批上市，与国外同类产品细胞工厂培养工艺比较，微载体技术可大幅提高细胞密度和培养基利用率，生物反应器的全自动化控制培养条件及全封闭管路系统，即使不添加抗生素，也能有效控制污染，同时降低了批间差异，提高了培养规模和效率，使产品质量更稳定、均一、可控［21］。

CAI 等［22］选取江苏省淮安市涟水县常住狂犬病感染高危风险区10 ～60 岁的健康人群，随机分为试验组和对照组，每组600 名，按“Essen”暴露后接种程序，分别于第 0、3、7、14 和 28 天经上臂三角肌肌内各注射1 剂疫苗，试验组接种国产冻干人用狂犬病疫苗（HDC），对照组接种进口冻干人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）。所有受试者在每次接种后留观30 min，观察即时反应，并于第 6、24、48、72 h 观察局部和全身反应情况。在首剂免疫前和免疫后7、14、42 d 采集全血标本，分离血清，采用WHO 推荐的快速免疫荧光灶抑制试验（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）检测血清中和抗体，计算抗体阳转率及几何平均滴度（GMT）。结果表明，所有受试者接种疫苗后反应轻微，均在72 h 内恢复，未发生Ⅲ级及Ⅲ级以上不良反应。试验组和对照组局部反应总发生率分别为7.67%和6.83%，全身反应总发生率均为5.00%，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。试验组和对照组首剂免疫后 7、14、42 d 的抗体阳转率分别为28.77%、100.00%、100.00%和28.72%、98.96%、100.00%，两组间差异均无统计学意义（P＞ 0.05）；血清中和抗体 GMT 分别为 0.274 8、19.744 3、37.575 0 IU ／ mL 和 0.247 4、17.327 4、37.723 0 IU ／ mL，两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明国产冻干人用狂犬病疫苗（HDC）具有良好的安全性及免疫原性。

MAO 等［23］采用 KMB17 细胞生产人用狂犬病疫苗，该疫苗是将狂犬病固定毒CTN-1V5 株连续在KMB17 细胞中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，从而筛选高适应性，且具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病病毒株，培育出可在KMB17 细胞中高效增殖的狂犬病疫苗毒种（CTN-DK 株）。

CHEN 等［24］为确定狂犬病病毒 PM 株在 2BS 细胞中增殖的最适MOI，将狂犬病病毒PM 株按MOI =0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 接种至 2BS 细胞中，显微镜观察接种病毒后细胞的形态变化；培养3 ~ 5 d 后，第1 次收获病毒液；更换培养液继续培养3 ~ 4 d 后，进行第2 次收获。采用小鼠脑内滴定法测定狂犬病病毒滴度，人用狂犬病疫苗效价测定法（National Institutes of Health，NIH）测定灭活病毒液的效价。结果显示，当MOI 为0.05 ~ 0.10 时，细胞圆缩30% ~ 40%，细胞能维持较好的生长形态，收获液的病毒滴度较高（> 5.0 lgLD50／ mL），灭活后病毒液的效价较高（> 4.0 IU ／ mL）。

有研究采用狂犬病病毒固定毒CTN-1V 株经昆明小鼠鼠脑回传后，接种至Walvax-2 细胞，连续传代，检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果显示，CTN-1V 株能较好地适应Walvax-2 细胞，连续传代至第 7 代，病毒滴度可达 6.78 lgLD50／ mL，并在第10 ~ 15 代内滴度维持在 7.0 lgLD50／ mL 以上，15 ~30 代滴度约稳定在 7.0 lgLD50／ mL。以第 15 代适应毒株CTN-1V-HDC P15 制备疫苗原液，各项指标均符合《中国药典》三部（2010 版）［25］的要求，疫苗效力达6.0 IU ／ 剂以上。接毒时，采用人二倍体细胞量 ≥ 2 亿，37 ℃悬浮混合吸附 30 min，MOI 为 0.05；接毒后，采用DMEM + 0.3%人血白蛋白作为病毒维持液（pH 7.8 ~ 8.0），培养 3 d 开始收获病毒液，更换维持液，继续培养5 及7 d，收获病毒液，通过动物法和细胞法测定收获液的病毒滴度，3 次收获液的病毒滴度均> 7.0 lg LD50／ mL。上述研究建立了稳定的狂犬病病毒株CTN-1V 在Walvax-2 细胞株上的病毒收获液制备工艺。所获Walvax-2 株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC，可用于人用狂犬病疫苗的生产开发［26-28］。

另外，北京一家生物科技公司与法国赛诺菲巴斯德公司合作的冻干人用狂犬病疫苗（HDC）技术转让项目已落实，此项目受科技部2011 年度国际科技合作与交流专项经费支持［29］。

3 小 结

HDC 不存在致瘤的潜在危险性，且与人的抗原性一致，避免了疫苗中宿主蛋白和外源DNA 残留的问题，这是人用狂犬病疫苗的两个重要质量控制指标［30］，排除后理论上可将疫苗引起过敏反应的可能性降到最低，从而提高疫苗的安全性。目前，人二倍体细胞株已被广泛应用于病毒学、细胞学、遗传学和肿瘤学等方面的研究和实践，特别是在病毒性疫苗的制备上，这类细胞株作为一种比较理想的细胞基质开始受到重视。但从人体胎儿组织中获得合格的人二倍体细胞株是极困难的，其原因为：严格的伦理审查的要求；环境退化的可能性和食品安全危害均可能导致染色体畸变，如核型的非整倍体和多倍体的存在［31］。最重要的是，对于通过流产获得合适的组织以获得HDC 的方法要求严格，使获得适当的细胞来源更困难，即使成功获得1 株新的HDC，由于其不能维持多次传代，可能也不能满足工业生产的要求，如 IMR-9 细胞系［32-33］。由于 WI-38 细胞供应减少，MRC-5 已成为生产HDCV 应用最广泛的细胞株。但我国应用MRC-5 细胞主要依赖于国外供应，因此细胞进口国家的政策将影响疫苗生产；另外，进口的MRC-5 细胞通常高于20 代，其生长活力的降低也将限制大规模生产。

近年来，国内多家公司也在进行HDC 的研究，逐步建立拥有自主知识产权的人二倍体细胞株，包括北京科兴中维生物技术有限公司建立的SV-1 株、北京民海生物科技有限公司建立的MHL-3 株和云南沃森生物技术股份有限公司建立的Walvax-2 株。其中，北京科兴中维生物技术有限公司自建的SV-1株已通过专家认证，用此细胞基质研发的水痘减毒活疫苗现已完成临床评价。北京民海生物科技有限公司自建的MHL-3 细胞株也已完成自检，并通过中国食品药品检定研究院的复合检定［34］。

近年，人用狂犬病疫苗产品质量得到了有效提升和发展，国产HDCV 将带动国内狂犬病疫苗产品升级更新，后续应对国产HDCV 暴露前和暴露后免疫的安全性、免疫原性及接种程序的临床应用进行进一步深入研究。