SA14-14-2 株乙型脑炎减毒活疫苗的应用现状、安全性评价及发展趋势

俞永新，李玉华，贾丽丽

中国食品药品检定研究院，北京102629

流行性乙型脑炎（简称乙脑）是由乙脑病毒引起的一种人类神经系统疾病，由蚊虫传播，主要在亚洲地区流行。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年有临床症状的乙脑病例约5 万多例，病死率为20% ~30%，幸存者中30% ~ 50%有长期的神经系统症状和后遗症。预防乙脑的有效手段是接种乙脑疫苗。近年来，乙脑发病率大幅下降，基本得到控制，余向东［1］指出，主要原因是疫苗的大面积预防接种，特别是近20 年来乙脑减毒活疫苗的接种。

当前全球广泛应用的乙脑疫苗有3 种：一种是由中国生产的SA14-14-2 株地鼠肾细胞制备的疫苗（简称乙脑减毒活疫苗），另两种也均是基于SA14-14-2 株全病毒和部分基因制备的灭活疫苗（IC50）和乙脑 ／黄热（JE ／YF）嵌合体活疫苗JE-CV（IMOJEV）。中国自主创新研制成功的SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗由国药中生成都生物制品研究所有限责任公司（简称成都生物公司）生产，生产用SA14-14-2 株毒种是经细胞培养和动物非神经组织多次交叉传代减毒及空斑试验10 多次筛选获得的高度减毒株［2-4］。多种敏感动物脑内注射该病毒株不致病，其表型及基因型十分稳定，免疫原性良好，能诱发较强的体液免疫和细胞免疫应答［5-6］。另两种疫苗均以SA14-14-2株病毒为基础［7］，一种是法国巴斯德公司生产的乙脑 ／ 黄热（JE ／ YF）嵌合体活疫苗 JE-CV（IMOJEV），该疫苗生产用毒种是将SA14-14-2 株具有免疫保护作用的关键蛋白基因片段（preM 和E）替换17D 黄热病毒的相应部位基因而产生的JE ／ YF 嵌合体病毒，以其作为生产用毒株在Vero 细胞中培养制成活疫苗，该疫苗已获得WHO 的批准，美国和其他西方国家也批准应用；另一种灭活疫苗的生产毒种是SA14-14-2 毒株在狗肾细胞中传8 代，再经Vero 细胞培养后，用甲醛灭活，加0.1%氢氧化铝佐剂制成灭活疫苗，称为IC50 或IXIARO 疫苗，由奥地利Valneva 公司，以前的Intercell Biomedical Livingston UK生产，美国Novartis 公司分发，该疫苗常规免疫程序为2 针，间隔21 d，已在美国等10 多个西方国家批准应用［8］。本文对SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗自1989 年上市以来，在中国和其他亚洲地区的应用现状、安全性及发展趋势作一概述。

1 SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗的应用现状

SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗在亚洲大规模应用后，有效控制了乙脑在当地的流行。2006 年，成都生物公司与美国帕斯适宜卫生科技组织（Program for Appropriate Technology in Health，PATH）合作，启动乙脑疫苗WHO 预认证项目，2013 年，成都生物公司乙脑减毒活疫苗获得WHO 预认证，成为中国具有参与联合国机构医疗采购资格的第一个疫苗产品，目前已有12 个国家的5 亿名儿童接种了成都生物公司的乙脑减毒活疫苗，保护了儿童免于乙脑导致的死亡或残疾［9-11］。

美国疾控中心几位著名专家发表文章称［12］，当前全球有几种乙脑疫苗可供选择，但成都生物公司制备的乙脑减毒活疫苗已获WHO 预认证，并同时获得全球疫苗和免疫联盟（Global Alliance for Vaccines and Immunization，GAVI）的财政资助，因此，最利于低中收入国家乙脑疫苗的持久性免疫预防接种。

1.1 国内应用 该疫苗于1989 年上市并开始在国内应用，2006 年纳入国家免疫规划中，在全国各省市全面接种，至今使用量已超过10 亿剂，预防效果十分显著，乙脑年发病率持续下降。据中国CDC 统计，2006 年乙脑纳入免疫规划后至2018 年，乙脑病例从2007 年的4 330 例下降至1 800 例，其中15 岁以下儿童从 2007 年的 3 752 例（1.50 ／ 10 万）下降至2018 年的 378 例（0.16 ／ 10 万），同期未免疫的 ≥40 岁成年人病例从 259 例（0.05 ／ 10 万）上升至1 153 例（0.18 ／ 10 万），在乙脑总发病例中，成年人比例从6.0%上升至64.0%［13-14］。贵州省是中国乙脑高发省份，2006 年将乙脑减毒活疫苗纳入常规免疫和强化免疫后，全省乙脑发病率大幅下降，2019年全省乙脑发病率（0.06 ／ 10 万）较 2007 年（1.59 ／10 万）下降96%［15］。近年来，未免疫的成人乙脑病例在我国北方地区出现高发趋势，2018 年北方11个省的乙脑病例为1 330 例，南方14 个省为470例，在乙脑总发病例中，成年人已成为乙脑发病的主要人群，并时有暴发流行［14］，国内对乙脑的免疫预防不能松懈。

1.2 国外应用 SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗于2002 年在韩国取得临床观察许可证，首次应用于国外市场。1999 年，在尼泊尔对16 万1 ～16 岁儿童进行了大规模接种（每人1 剂），结果显示，在接种率高的地区乙脑确诊病例仅49 人，接种率低的地区乙脑确诊病例高达2 084 人，确诊的住院患者（227例）中，无1 例有乙脑减毒活疫苗接种史，保护率达99.3%［16］，疫苗接种后第 2、5 年，保护率分别为98.5%和 96.2%［17］。2007 年，在印度对 930 万 1 ～15 龄儿童接种乙脑减毒活疫苗（每人1 剂），保护率为 94.5%［18］。2004 — 2014 年，在尼泊尔对 31 个大规模接种疫苗地区进行评估，结果显示，乙脑减毒活疫苗大规模接种后，乙脑确诊病例发生率为0.7 ／10 万，较该地区未接种疫苗的预计病例发生率下降78%，避免了3 011 名儿童乙脑病例及9 497 例急性脑炎综合征病例的发生，特别是在4 个高危地区，病例数下降尤为明显，数据显示，确诊的乙脑病例和急性脑炎综合征（acute encephalitis syndrome，AES）病例下降了 84%［19］。

2 SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗的安全性

2.1 国内外应用的安全性 在国内，乙脑减毒活疫苗上市前，进行了1 千多人的临床观察［20］，之后中国又进行过两次大规模有计划有组织的免疫接种观察：一次是1993 年在四川省成都市5 个地区，观察人数达50 多万人［21］；一次是1998 年在湖北省，观察了 6 万多名 1 ～ 10 岁儿童［22］。另外，1997 年由中美科学家合作，在四川省成都市对1 ～2 岁儿童接种组和对照组各1 万多名进行了双盲随机观察［23］。上述观察结果均未发现因乙脑减毒活疫苗引起的脑炎相关病例。在国外，1999 年在尼泊尔对16 万1 ～ 16 岁儿童、2007 年在印度对 930 万 1 ～5 岁儿童、2012 年在斯里兰卡对9 月龄儿童均接种1 针乙脑减毒活疫苗，均未发现与疫苗相关的乙脑病例［8，16，18］。自 1988 年以来，SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗已在不同国家进行了10 多次有计划的免疫接种安全性观察，其中包括2014 年中国CDC 和广东省的两次大规模临床观察［24-25］，均未发现该疫苗引起的脑炎病例。2017 年，几位国际知名专家对1995 — 2015 年10 年间在中国和亚洲不同国家的16 次大规模临床安全性观察资料进行总结和分析评估，结果表明，自1988 年以来，SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗在全球发出了5 亿剂，对8 月龄以上大范围年龄人群均有良好的耐受性，并未发现接种乙脑减毒活疫苗后出现的个别严重不良反应与疫苗有关的足够证据。乙脑减毒活疫苗在中国和亚洲大规模应用后，未发现与疫苗相关的脑炎确诊病例［26］，其安全性也得到了WHO 的认可。WHO 全球疫苗安全委员会（GlobalAdvisoryCommitteeonVaccine Safety，GACVS）曾多次召开会议，探讨乙脑减毒活疫苗的安全性试验资料，并确认其具有可接受的大范围安全性［27-28］。WHO 在一次讨论会上根据 GACVS 的多项报告，也认为成都生物公司生产的乙脑减毒活疫苗具有可接受的大范围安全性［29-30］。

2.2 地鼠肾细胞及SA14-14-2 株毒种的安全性

尽管乙脑减毒活疫苗的安全性和保护效果已被国内外专家及WHO 肯定，但西方国家个别学者认为SA14-14-2 株地鼠肾细胞疫苗是应用动物原代细胞生产的疫苗，可能存在外源病毒污染的风险［31］，且病毒的神经毒力存在回复突变的可能，有报道称，应用地鼠肾细胞生产的疫苗尚未经WHO 认可［32］。

WHO 对中国的乙脑减毒活疫苗通过长期调查及相关知名专家认可后，于2002 和2003 年两次在北京召开WHO 生物制品标准化委员会扩大会议，邀请了国内外生物制品知名专家，其中包括WHO生物制品标准委员会主任Petricciani 教授，WHO 生物制品质量保证与安全部的Griffiths，WHO 疫苗与发展部的Pervikov，WHO 官员英国生物制品标准化与质量控制部的Woods，美国FDA 生物制品评价与研发中心的Reeve，中国食品药品检定所所长周海钧等。主要讨论中国SA14-14-2 减毒株的神经毒力及用于疫苗生产的安全性和疫苗质量的可控性等，以及地鼠肾细胞用于疫苗生产的安全性，最终认可SA14-14-2 株毒种为疫苗生产用毒株，地鼠肾细胞为生产用细胞基质以及质量控制技术的有效性和可控性，制定了WHO 人用乙型脑炎减毒活疫苗生产和质量控制指南（WHO Tech Rep Series 910，First report 2002）［33］。2012 年，WHO 又召开会议进行了补充修订及肯定［34］。2013 年，WHO 专家组用 7年时间对成都生物公司的生产车间、SPF 地鼠质控和标准以及生产工艺、质量控制标准和临床资料等进行了全面检查，结果均符合标准，2013 年获得WHO的预认证，专家组未提出应用SPF 地鼠肾细胞生产的疫苗的不安全性。2015 年最新的一次WHO 会议再次肯定了SPF 地鼠肾细胞生产的减毒活疫苗的安全性［29-30］。

2.2.1 地鼠肾细胞 成都生物公司在中国首次成功建立了SPF 地鼠群用于疫苗生产，地鼠样品包括地鼠血清、地鼠肾细胞，用地鼠肾细胞生产的疫苗样品经英国权威实验室Q-one biotech LTD 全面安全检测，包括10 种小鼠病毒，18 种地鼠病毒，全部人、牛、猪病毒检测，结果均为阴性，符合国际标准，特别是不含逆转录病毒［35］。

2.2.2 SA14-14-2 株毒种 个别学者对疫苗弱毒可能回复问题的报道主要有以下3 点：①中国SA14-14-2株减毒活疫苗对小白鼠仍有致病性，高滴度病毒（PFU > 104）通过脑内注射可引起小鼠发病死亡［36］；②SA14-14-2 株病毒基因序列均一性差，不同实验室测序的序列不完全一致［37］，因此认为SA14-14-2株存在遗传稳定性差和神经毒力返祖的危险性；③SA14-14-2 株病毒疫苗安全有效，但仍存在可能弱毒回复为高毒力的理论上的危险（theroretical risk），从而限制疫苗的全球使用［38］。经查阅文献发现，文章作者所用的SA14-14-2 病毒株为市售成都生物公司疫苗，病毒经高度致癌的BHK21 细胞传代后再注射小鼠，不能代表真正的SA14-14-2 原始病毒株，SA14-14-2 株病毒经3 周龄幼鼠脑内接种无致病性，除中国食品药品检定研究院虫媒病毒室（简称中检院虫媒病毒室）多次实验证明外，国内外很多不同实验室包括日本和美国等均有报道证实［39-40］。为进一步证实，中检院虫媒病毒室最近又用昆明瑞士种和ICR 两种品系小鼠重复实验，均未发现小鼠致病。上述有关基因序列不一致的原因是不同实验室将SA14-14-2 株病毒通过不同种类细胞传代后测序的结果，不能代表SA14-14-2 原株序列。中检院虫媒病毒室最近又重新对SA14-14-2 株原始毒种、主毒种和生产毒种进行了全基因测序，结果3 个毒种序列一致，未发现不均一性［41］。另外，对疫苗生产企业生产的3 批成品疫苗病毒进行全基因测序，也未发现其不均一性［42］。

有关SA14-14-2 株病毒弱毒特征的稳定性是否可能回复突变而影响环境污染，有报道称，孕猪注射乙脑SA14-14-2 株减毒活疫苗后流产，说明弱毒毒力的回复突变［43］。但从流产胎儿分离到的病毒，其表型和基因型仍保留SA14-14-2 株特征不变，即对乳鼠致病，而对幼鼠脑内接种不致病，其核酸和氨基酸序列与SA14-14-2 株的同源性不变，分别为99.7%和99.6%［44］。表明SA14-14-2 株的弱毒稳定，通过胎儿后的表型和基因型不变，引起流产是SA14-14-2株对乳动物具有致病性的本身特征，而不是弱毒回复突变。中检院虫媒病毒室最近将病毒通过蚊虫（胸内）猪体（病毒血症）蚊虫（胸内）交叉传代，最后从蚊虫收集的病毒经细胞传代扩增后进行表型和基因型特性实验，结果显示，病毒对小鼠脑内无致病性，全基因氨基酸序列与原SA14-14-2 株一致，表明病毒经不同宿主反复交叉传代，其弱毒特征也很稳定，未发生回复突变［45］。另外，杨会强等［46］从 3 批SA14-14-2 株减毒活疫苗中经空斑纯化出24 株（每批8株）病毒，对每株病毒包膜蛋白基因进行测序并与SA14-14-2 原病毒株序列比对，结果显示，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为≥99.9%和≥98.8%，其中仅发现1 ~ 2 个氨基酸位点差异，差异位点未发生在与疫苗株毒力密切相关的8 个关键位点上。另外，中国农业部已批准将SA14-14-2 株用于生产预防猪感染乙脑的减毒活疫苗，已有多家企业投入生产，年产量达6 000 多万份，大量猪疫苗的应用，未发现病毒传播到自然环境，包括蚊子和动物，表明SA14-14-2 株减毒活疫苗的弱毒稳定，不会造成环境污染［47］。

SA14-14-2 株减毒活疫苗不可能发生毒力返祖的安全性还可通过10 亿人接种未发生与疫苗相关病例证实，如与当前西方国家普遍应用的黄热病17D 活疫苗相比，该疫苗病毒对小白鼠脑内毒力可达 103LD50，猴体实验可允许死亡 1 ／ 10 只，而SA14-14-2 株均为0。17D 疫苗的临床观察已确认嗜神经疾病为（0.25 ~ 0.4）／ 10 万（北美国家）、1.1 ／ 10 万（巴西），嗜内脏性为（0.3 ~ 0.4）／ 10 万，在 60 岁以上人群中为（1.4 ~ 1.8）／ 10 万［48］。

3 发展趋势

3.1 增加SA14-14-2 减毒活疫苗的品种 以Vero细胞为基质的SA14-14-2 株减毒活疫苗比法国巴斯德公司生产的仅含SA14-14-2 株部分基因（PrM 和E）的乙脑 ／ 黄热（JE ／ YF）嵌合体活疫苗更有优势。首先，其免疫性优于乙脑 ／ 黄热（JE ／ YF）嵌合体活疫苗，因为 SA14-14-2 株是全病毒，而 JE ／ YF 疫苗中仅含SA14-14-2 株的结构蛋白（PrM 和E），缺乏乙脑病毒非结构蛋白（NS），而目前普遍认为黄病毒内NS 蛋白是诱生细胞免疫保护作用的主要蛋白［49-50］。实验证明，SA14-14-2 疫苗免疫动物能产生很强的细胞免疫和保护效果［3，51］。NS 蛋白中的 NS3 细胞免疫效果很强［52］，NS1 具有很强的免疫保护作用［53］。登革热四价嵌合体疫苗（DEN ／ YF）即是以黄热病毒（YFV）的非结构蛋白为骨架组成的，其中缺乏DEN病毒的非结构蛋白，因此不能产生针对DEN 病毒的细胞免疫，而黄病毒间T 细胞交叉免疫又很弱［54］，记忆T 细胞在黄病毒疫苗中对保持疫苗免疫的持久性又特别重要［55］，因此，DEN ／ YF 四联疫苗的免疫性不全面、不持久，导致若干年后产生抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement，ADE）而难以进一步扩大应用，其原因有关专家分析为缺乏NS的 T 细胞免疫应答［49-50，56］和 NS1 抗体的免疫保护作用［57-59］。其次，在安全性方面，DEN ／ YF 嵌合体疫苗中的YF-17D 病毒曾发生过与黄热疫苗相关的病例，而SA14-14-2 株减毒活疫苗免疫10 亿人未发生与疫苗相关病例，因此，SA14-14-2 全病毒疫苗的安全性也优于 JE ／ YF 疫苗。

与当前西方国家广泛应用于旅游者的SA14-14-2 株 Vero 细胞灭活疫苗（IC50）相比，SA14-14-2 全病毒Vero 细胞活疫苗也具有更多优点，如仅需注射1 针，减少了旅游者出发前等待时间，不含氢氧化铝佐剂，减少了注射后局部副反应；另外，中国具有应用Vero 细胞生产多种疫苗的实际经验，如狂犬病疫苗、脊髓灰质炎疫苗、EV71 疫苗等，并可采用微载体培养技术大量生产，细胞培养纯化技术已很成熟，如DNA 杂质可降低至100 pg，低于WHO 的要求（10 ng）。另外，中国生产的Vero 细胞疫苗成本较低，有价格优势。因此，Vero 细胞SA14-14-2 株活疫苗比乙脑 ／ 黄热（JE ／ YF）嵌合体活疫苗和 Vero 细胞灭活疫苗更安全、有效、价廉，具有全球推广应用的优势。

3.2 改进和完善免疫程序 目前，已有12 个国家的6亿儿童接种成都生物公司生产的地鼠肾细胞SA14-14-2 株减毒活疫苗，避免了数百万儿童的死亡和瘫痪。但在已接种疫苗的地区，疫苗接种还存在接种率低以及仅注射1 针免疫持久性不长的问题［60-61］。有报道表明，注射1 针抗体水平较低，加强注射1 剂，抗体水平有显著提高，预计免疫持久性会更长［62-64］，因此，通过加强注射来维持最大限度的持久性保护十分重要。乙脑减毒活疫苗在国外的免疫策略应重新考虑与国内接种2 针相同的方案。

3.3 扩大疫苗的产量和应用 在亚洲，一些尚未应用中国乙脑减毒活疫苗的国家正在考虑申请资助和应用，而已纳入免疫规划的国家，如采用2 针免疫程序和提高免疫覆盖率，将大幅提高国外乙脑疫苗的需求量。而国内近年来成年乙脑病例在我国北方地区出现高发趋势，并时有暴发流行，已成为乙脑发病的主要人群，为我国乙脑防控提出了新的挑战［14，65］。对成年人进行乙脑疫苗免疫十分必要。因此，乙脑疫苗在全球的需求量将大幅增多。疫苗生产企业应扩大生产地鼠肾细胞乙脑减毒活疫苗，另一方面应尽快研制Vero 细胞SA14-14-2 株全病毒疫苗。

3.4 疫苗质量提升 疫苗质量应进一步提升，如去除疫苗保护剂中的明胶以及增加5 人份疫苗人白蛋白含量，以提高疫苗在热带地区的热稳定性等，进一步提高疫苗的有效性和免疫持久性。

综上所述，乙脑是自然疫源性疾病，大规模预防接种可有效控制发生地的乙脑流行。应尽快研制Vero 细胞SA14-14-2 株乙脑全病毒疫苗，扩大疫苗的国际市场，使中国首创的SA14-14-2 株乙脑减毒活疫苗能更好地服务于全球健康。