柑橘酒酶法脱苦工艺的研究

张方艳，童 芳，刘美伶，韩守建，朱桂兰

(合肥师范学院 生命科学学院，安徽 合肥 230601)

柑橘类水果在热带、亚热带等许多地区都有广泛种植，年产量约为1.02亿吨，是全球最重要的经济作物之一，也是世界第一大类水果[1]。柑橘在我国南方广泛种植，是南方最重要的经济果树之一[2]，截至2019年，我国柑橘产量达4584.5万吨[3]。柑橘中含有黄烷酮、酚酸、柠檬苦素、L-抗坏血酸、类胡萝卜素、挥发性萜烯等多种生物活性化合物[4]。因此，橘类水果具有颜色亮丽、香气怡人、口感酸甜、营养丰富等特点，受到全世界消费者的喜爱。随着我国柑橘产量的逐年增加，我国的人均鲜果消费已明显高于世界平均水平，存在总量过剩、结构性过剩、季节性过剩、低品质类型过剩等问题，难以满足消费者日益多元化、个性化的需求[3]。解决这一问题的关键就是对柑橘进行深加工。

目前，柑橘加工产品有橘子罐头、果酱、橘子果汁、橘子果酒等，其中柑橘果汁和果酒的加工都需要榨汁，但柑橘在经过榨汁、杀菌、贮藏等加工环节后会出现苦味增强的现象，影响柑橘汁或酒的口感，导致产品质量和经济价值下降，消费者可接受度降低，制约了柑橘果汁和果酒加工业的发展[5]。虽然柑橘酒中含有丰富的VA和VC，对增强免疫力、维持机体机能有重要作用[6]，同时还含有丰富的矿物质元素[7]，但对其研究一直停留在试验阶段。令其无法像葡萄酒一样进入产业化生产的原因主要来源于其加工后产生的“后苦味”，这类苦味物质严重影响了柑橘酒的口感，因此，对柑橘酒进行脱苦是柑橘酒发展的关键。研究发现，造成口感苦涩的原因是柑橘中自带的柚皮苷[8]，所以去除柚皮苷就成了酿造柑橘酒的关键步骤。目前常用的脱苦方法有酶法脱苦、遮蔽法脱苦和吸附法脱苦等[9]。本实验利用酶法对柑橘酒进行发酵前后脱苦，对比脱苦效果，并优化脱苦工艺，为改进柑橘酒脱苦技术提供一定的理论支持，以期改善柑橘酒的品质，推动柑橘酒产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料及试剂

柑橘：广西皇帝柑。

食品级柚苷酶，江苏鑫瑞生物科技；果胶酶，绿城食化；亚硫酸钠，厦门墨奕怀食品有限公司；二甘醇，华胜化工；柚皮苷(标准品)，成都麦德生科技有限公司。

1.1.2 试验设备

HH-4数显恒温水浴锅，金坛杰瑞尔电器有限公司；FA2004B型电子分析天平，上海市安亭电子仪器厂；九阳JYL-C051型榨汁机，九阳有限股份公司；V-5100B可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；阿贝折光仪，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 柚皮苷标准曲线的制备

参考戴维斯法[10]，稍有改动。以吸光值A和柚皮苷标准品的量(mg)来制作柚皮苷标准曲线：A=2.1994X+0.093，R2=0.9984。

1.2.2 柑橘酒的酿造工艺

原料→挑选→去皮去核→破碎榨汁→添加果胶酶处理→添加酵母发酵→倒酒，澄清→得到柑橘酒。

1.2.3 脱苦处理

考察柚苷酶加入时期对脱苦效果的影响。(1)发酵前直接对橘子汁进行脱苦处理，即向100mL橘子汁中加入不同量的柚苷酶，在40℃水浴反应30 min，酶解完成后接种酵母发酵，发酵结束测定酒液中柚皮苷含量。(2)对发酵后的橘子原酒液进行脱苦处理，即向100mL橘子原酒液中加入不同量的柚苷酶，在40℃水浴反应30 min，酶解完成测定酒液中柚皮苷含量。柚苷酶添加量分别为0.02 g、0.04 g、0.06 g、0.08 g、0.10 g。

1.2.4 柚苷酶单因素实验

对橘子原酒进行酶解脱苦的单因素实验，考察酶解的pH(3、4、5、6、7)、酶解温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、酶解时间(20 min、40 min、60 min、80 min、100 min)对脱苦效果的影响，结合脱苦率及感官评价，确定单因素最佳水平。

1.2.5 柚苷酶脱苦条件优化

在单因素实验的基础上以pH值、酶解温度、酶解时间最佳水平设计正交试验。具体见表1。

表1 正交试验因素及水平表

1.2.6 柑橘酒发酵前后柚皮苷含量的测定以及脱苦率的计算

参考李利君[11]等人的测量方法，使用可见光分光光度计，在420 nm波长处用二甲醇和氢氧化钠混合液作为显色液与柚皮苷发生显色反应，测量其吸光度值。通过柚皮苷标准曲线标线确定其中柚皮苷的含量。

脱苦率用去除柚皮苷的程度来表示，计算公式为

式中D为脱苦率(%)，C为脱苦前柚皮苷含量(mg/mL)，C1为脱苦后柚皮苷含量(mg/mL)。

1.2.7 柑橘酒的感官评价以及评分

参考蒋燕明等人[12]的感官评价方法，稍有改动，柑橘酒的感官评分表见表2。

表2 柑橘酒感官评价表

1.2.8 数据统计分析

利用Excel 2010、SPSS 22及Origin2019等软件对实验所得数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 柚苷酶加入时期及其添加量对于脱苦效果的影响

探究柚苷酶加入时期对效果的影响，结果如图1和图2。从两图横向观察，酶添加量0.2 g/L～0.6 g/L时，脱苦率和感官评分随着酶添加量的增加而增加；当酶添加量达到0.6 g/L时脱苦能力最大，此时对发酵前果汁进行酶处理的脱苦率为62.2%，对发酵后原酒进行酶处理的脱苦率77.3%；酶添加量超过0.6 g/L时，脱苦能力趋于稳定。由两图纵向对比可知，同一酶浓度下，对发酵后原酒进行脱苦的效果明显优于发酵前对果汁进行的脱苦效果。原因可能是发酵后柚皮苷被充分释放，更有利于柚苷酶将其去除。在进行感官评定时发现，当酶添加量超过0.6 g/L时，酒液的口感会随着酶添加量的增加而变差。因此，选择对发酵后原酒进行柚苷酶脱苦，且酶添加量为0.6 g/L为宜。

图1 柚苷酶发酵前添加和发酵后添加对脱苦率的影响

图2 柚苷酶的添加时期和添加量对感官评分的影响

2.2 单因素对于脱苦效果的影响

2.2.1 pH值对于脱苦效果的影响

探究pH值对于脱苦效果的影响，结果如图3。由图3可知，脱苦率随着pH值3～7先降低后增加，这可能是因实验所用的柚苷酶为混合酶，即为真菌来源和细菌来源的混合柚苷酶，真菌来源的柚苷酶在酸性条件下更稳定，而细菌来源的柚苷酶更适合偏中性的环境条件。因此，在pH3.0和pH7.0时能最大地发挥柚苷酶的活性，使之最大限度地作用于柚皮苷，增加酶与底物的反应速度。在上述2个条件下脱苦率分别为83.56%、81.38%。但进行感官评价时发现pH3.0时酒液口感不好，因为酒液酸度过高影响了酒液的口感，感官评分仅61.43分，而pH7.0的感官评分为78.63分。综合考虑，选用pH7.0作为本实验酶反应的最适pH。

图3 pH对脱苦效果的影响

2.2.2 酶反应时间对于脱苦效果的影响

探究酶解时间对于脱苦效果的影响，结果如图4。从图4可知，酶解时间对脱苦率影响不明显，只有在酶解60 min时脱苦率稍高，之后趋于稳定。在进行感官评价时发现几组酒液在口感上的差距较小，很难区别出更好。所以酶解时间对脱苦效果影响较小，暂定酶解时间60 min为宜。

图4 反应时间对脱苦效果的影响

2.2.3 反应温度对于脱苦效果的影响

探究酶解温度对于脱苦效果的影响，结果如图5。酶解温度在30℃～50℃范围时，脱苦效果随着温度的升高而增大，当酶解温度在50℃时，脱苦效果最好，脱苦率为65.26%，感官评分73.43分。当酶解温度超过50℃后，脱苦效果随着温度的上升而降低。原因可能是温度升高，酶蛋白结构发生变性而导致柚苷酶活性降低或丧失，从而脱苦能力降低[14]。因此，选择酶解温度为50℃。

图5 酶解温度对脱苦效果的影响

2.3 正交试验确定最佳脱苦条件

在单因素试验基础上确定脱苦处理选择在发酵后对原酒进行酶处理，酶添加量为0.6 g/L。按照pH值、反应温度、反应时间最佳水平设计正交试验[13]。柑橘酒脱苦工艺优化试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

表3 正交试验结果和直观分析表

表4 正交试验方差分析表

由极差R可知，影响脱苦效果的因素依次是pH值>酶解温度>酶解时间，即柚苷酶反应的最佳pH对脱苦效果影响最大，影响最小的是酶解时间。由均值可得最优组合是A3B2C3，既是pH值为7、酶解温度50℃、酶解时间为60 min，在此条件下对柑橘原酒进行柚苷酶脱苦处理效果最好。

由方差分析可知pH值和酶解温度的P值小于0.05，说明pH值和酶解温度对于柚苷酶脱苦效果具有显著性。酶解时间的P值大于0.05，说明其对于柚苷酶脱苦效果的影响不显著。

2.4 验证实验

根据正交试验确定的实验组合A3B2C3即pH值为7、酶解温度为50℃、酶解时间为60 min，按照该条件对100 mL柑橘原酒进行脱苦处理，加入0.06 g的柚苷酶并调整pH到7，在50℃水浴反应60 min，反应结束后测量其脱苦率。并对正交试验的9组酒液和验证组的酒液进行感官评价。结果见表5。

表5 感官评价表

由表5可知，酒液的脱苦率与感官评分成正比关系。未脱苦处理的原酒液口感苦涩无法下咽，在经过脱苦处理后口感有着明显的提升。而验证组的脱苦率达到了64.05%,高于其他组，相应的感官评分也远高于其他组，达到了81.26分。说明实验结果与正交试验结果一致。

3 结论

本实验采用酶法对柑橘酒进行脱苦处理，考察柚苷酶的加入时期和添加量对脱苦效果的影响，同时优化脱苦条件对脱苦效果的影响。实验结果表明：发酵后对原酒液进行酶脱苦处理的效果要优于发酵前对鲜榨柑橘汁进行酶脱苦处理，同时柚苷酶最适添加量为0.6 g/L；正交试验优化的最佳脱苦条件即pH7、酶解温度50℃、酶解时间60 min，在此条件下处理的橘子原酒，脱苦率为64.05%，感官评分81.26分。试验结果表明，柑橘酒经柚苷酶脱苦处理方法可行，不仅改善了酒体的苦味，还提升了酒体的品质，为柑橘酒的制备工艺改良提供理论参考。