线栓法制备大脑中动脉闭塞大鼠模型问题探析

谌爱华，王妙华，廖鑫，吴天唯，曹晨曦，邓凯文

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

缺血性脑卒中指各种原因所致的脑部血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧坏死，出现相应的神经功能缺损症状，是当前危及人们生命健康的三大主要疾病之一，具有高病发率、高病死率、高复发率的特点［1-2］。为研究缺血性脑卒中的发病机制及筛选有效治疗方案，提高缺血性脑卒中的治愈率，实验动物研究成为首选。常用的动物包括大鼠、小鼠、兔等，大鼠因脑血管解剖与人类相近，且具有成本低、繁殖快的优点，故被选为制备脑缺血模型的最常用动物［3］。建立大鼠脑缺血模型方法多样，如光化学法、线栓法、电凝法、三氯化铁法，其中线栓法以不开颅、效果肯定、可准确控制缺血时间等优势而被广泛应用［4］。笔者在运用线栓法复制大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型时，将遇到的问题做如下阐述。

1 大鼠的选取

1.1 大鼠的品系缺血性脑卒中模型常用的大鼠品系主要有Sprague-Dawley大鼠、Wistar大鼠、Long-Evans大鼠等。大脑中动脉缺血后，不同品系大鼠脑部梗死区域面积及稳定性不一。与Sprague-Dawley大鼠比较，Wistar大鼠血管变异率高，Long-Evans大鼠造模后缺血面积较小甚至无梗死［5］。研究显示，Sprague-Dawley大鼠颈部血管较为清晰，易于手术，且大脑中动脉变异小，脑缺血后梗死面积一致性高，故Sprague-Dawley大鼠为目前最常用的脑梗死模型［6-7］。

1.2 大鼠的体质量大鼠年老后其动脉硬化、管腔狭窄、血管弹性变差，血管脆性增加，造模时易损伤血管，增加模型的病死率，故选用青壮年大鼠。研究表明，体质量为260～300 g的大鼠最适宜做脑缺血模型［8］，体质量过小，其对麻醉药物的耐受性差，术后病死率高；体质量过大，血管增粗且变异增加，线栓难以充分阻断血流，梗死区域难以形成，导致成功率低［9］。笔者通过造模操作发现，体质量在260～300 g的大鼠颈总动脉相对较粗，剪切口时不易破坏血管而线栓更易穿入，较易控制脑梗死面积，而体质量超过300 g的大鼠，血管分叉更多，在分离血管时易将颈外动脉及其分支错认为颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，直接影响模型的成功率。

1.3 大鼠的性别流行病学表明，绝经后女性患脑梗死的比率与男性大致相当，可能与绝经后女性体内雌激素水平降低导致神经保护作用缺损有关［10-11］。故在研究脑梗死方面，不应忽视雌激素的作用，大鼠亦是如此。研究表明，雌激素可拮抗兴奋性氨基酸毒性、抑制炎症反应、抵抗氧化应激反应［12-13］。实验研究也显示，雌性MCAO模型大鼠在病死率方面显著低于雄性MCAO大鼠，雌激素具有周期性，且具有神经保护作用［14］，故MCAO模型常用雄性大鼠。

2 造模操作

2.1 术前的准备大鼠购至实验室后，需适应性喂养1周，正常饮食、饮水，保持实验室温度在25～30℃，昼夜温差保持在3℃以内，注意检查鼠笼的密封性及送风系统正常与否，勤换垫料。关于术前是否需要禁食。研究显示，高血糖可增加大鼠脑缺血损伤，故多数观点表明需要术前禁食12 h，不禁水［15］；另有研究表明，术前禁食会导致低血糖，低血糖也会导致大鼠病死率增加［16］。至于结果如何，可在实验中进一步摸索。

2.2 麻醉剂的选择麻醉是决定手术成败、动物存活与否的关键，目前常用的实验动物麻醉剂包括氯胺酮、乌拉坦、戊巴比妥钠、水合氯醛、异氟烷等。其中，氯胺酮麻醉起效快，但持续时间短，约10～20 min，能较大程度地抑制大鼠呼吸［17］；乌拉坦通过与胆碱酯酶结合达到麻醉的作用，虽麻醉效果稳定，但对大鼠平均动脉压及血液黏稠度有较大影响［18］；戊巴比妥钠麻醉时可引起动物强烈的四肢痉挛、强直，对体温及呼吸的抑制较明显［19］；水合氯醛起效时间短，但维持时间较长，对动物的呼吸频率、体温及心率的影响较戊巴比妥钠小，同时价格低廉、原料易得等优点［20］；异氟烷麻醉比较稳定，对脑温影响较小，但价格较贵。综合以上，制备脑缺血模型时常选用的麻醉药物为水合氯醛，浓度为10%，按0.30 mL·100 g-1给药，故注射麻醉药前需准确称量大鼠的体质量，为提高大鼠术后存活率，可先注射总剂量的4／5，如果麻醉不完全，可每次加注0.1 mL，补充麻醉药物时应避免过量注射，否则会导致大鼠因呼吸衰竭而死亡。麻醉时一般采用腹腔注射，需将针头放置于低位，使腹部脏器及肠管下移，针头以45°角经右下腹部斜刺入腹腔［21］，针刺深度不宜过深，避免刺伤脏器及肠管导致肠穿孔、肠麻痹等并发症，从而影响实验结果。

2.3 手术切口的选择手术切口主要选择大鼠颈部正中或者颈部正中偏左侧或右侧，然而颈部正中切口易损伤气管。研究表明，大鼠左侧的迷走神经直接分布于心脏，选择颈部左侧切口时，对心脏影响较大，导致术后病死率升高［22］，故造模时尽量选择颈部正中偏右侧颈总动脉搏动处切口，随后逐步分开皮肤与浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌之间的肌间隙，避免破坏肌纤维，在靠近气管处寻找颈总动脉，仔细分离颈总动脉及迷走神经，再向颈总动脉远心端分离寻找三岔口，钝性分离出颈内动脉及颈外动脉。为方便视野暴露及减轻操作风险，操作过程中可佩戴头灯。

2.4 线栓的选择制作线栓的材料包括鼠须、尼龙线、钓鱼线等。TANG Q等［23］把单股尼龙线一端加热，烧成直径略大于线栓本身的球形头端，可充分阻断大脑中动脉血流，减轻对血管壁的机械性损伤。制作球形头端后，还可在线栓前端表面涂以物质（石蜡、硅胶、多聚赖氨酸等）进行包被［24］。笔者通过实验发现，以石蜡覆盖头端稳定性欠佳，反复多次插入线栓时易出现石蜡脱落等情况。采用梭形头端与圆形头端进行比较发现，前者造成的梗死面积较后者大，且梗死变异率较低［25］，为制备线栓提供了新方向。对尼龙线包被材料进行观察发现，在牙用树脂、聚赖氨酸和硅酮3种包被材料中，以硅酮效果最佳［26］。结合价格及模型稳定性考虑，笔者实验时采用北京西浓公司生产的多聚赖氨酸包被的线栓。为降低线栓进入翼腭动脉的概率，需让线栓有一弧度。研究表明，260～300 g大鼠选用线栓最佳直径为0.25～0.28 mm，插入长度为18～22 mm［27］，具体深度宜视大鼠大小而定，可在距线栓头端18 mm处用作一标记，以便明晰线栓插入深度。

2.5 线栓入颅的部位及深度线栓的插入方法包括3种［28］：①由颈外动脉经颈内动脉向大脑中动脉插线；②经颈内动脉向大脑中动脉插线；③从颈总动脉经颈内动脉向大脑中动脉插线。经颈外动脉向颈内动脉插入线栓，操作时间长，且颈外动脉较细，线栓易错入翼腭动脉，因颈内动脉较细，操作时易损伤血管，致操作时间延长，操作时需尽可能暴露较长的颈内动脉，这样可增加对大鼠的损伤［29］。故笔者实验时采用线栓由颈总动脉进入，但若行再灌注操作，拔出线栓后其供血只能由另外一侧脑血管经大脑环供血，也为其缺点。经实践发现，线栓进入颅过程并非时时顺利，需要多加耐心，多次重复插入，过程中需用力应柔和，以免致血管断裂，线栓插入深度为（18±1）mm。固定线栓后即可进行缝合，若只需要复制脑缺血模型时，可将多余的线栓剪掉藏于体内，如需再灌注时，可将线栓尾端暴露于体外，用标记笔或标签纸进行标记。

2.6 注意事项因久置、光照、高温均可使水合氯醛分解，故麻醉药物应现配现用，避光保存，配麻醉药时尽量用蒸馏水，减少其他因素的干扰。因大鼠血管较细，故手术中需仔细谨慎，分离血管及迷走神经时注意钝性分离，避免因手术不当而致血管破裂或迷走神经断裂，导致大鼠创伤性死亡。术后易出现伤口感染，操作时需保证无菌设施及无菌操作，每次实验前均需对手术器械及线栓、麻醉药等进行灭菌或消毒处理。术中出血量多，易造成大鼠因休克而亡，造模后可视出血情况酌情补充生理盐水。术后大鼠因麻醉尚未完全清醒，大鼠体温较低，需要注意保暖。研究表明，造模成功后进行保温措施有助于增加造模成功率［30］，由于条件限制，具体实验时可用灯泡照射维持大鼠体温，或在大鼠表面铺上一层干净垫料。

2.7 术中、术后并发症及处理方式术中、术后并发症主要包括麻醉过量死亡、感染、大出血、蛛网膜下腔出血。出现感染主要是由于造模时不注重无菌操作所致，可于造模完成后腹腔注射青霉素G 20～30万单位，伤口缝合后可外擦适量青霉素抗感染。大出血的主要原因为插线栓时剪口过大，牵扯时用力过猛，致血管断裂，此时须立即夹闭血管断端，将颈总动脉远心端的备用活线在断端处打死结，再在颈总动脉上剪一小口，故第一次剪口时，应尽量靠近颈总动脉近心端。也有可能因线栓进入颈内动脉后所受阻力太大，用力过度，戳破血管，导致蛛网膜下腔出血，影响颅内血管微循环而亡，故操作时注意用力柔和，插线栓遇阻力时需保持心态平和，改变方向或重新插入。分离血管及迷走神经时，损伤神经亦会导致呼吸衰竭、心脏骤停，故钝性分离血管及神经时需仔细谨慎。

3 体会

线栓法制备脑缺血模型效果肯定，为实验室建立脑缺血模型的常用方法。动物品种及年龄的选择、麻醉剂选用、线栓处理及入颅深度、术后护理等因素均可影响造模成功率。复制成功的脑缺血模型，操作者需要仔细谨慎、熟悉大鼠解剖结构、提高手术熟练度，线栓入颅的部位及深度为影响造模成功的关键因素，不同研究者对线栓入颅的深度各有见解，笔者认为正式实验之前可行预实验研究，对所需品种及年龄的大鼠进行不同入颅深度测试，对大鼠进行神经功能缺损评分及采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑法对脑缺血梗死面积进行检测，获得最合适的线栓插入深度。对于造模失败的动物，应对其进行尸体解剖，一方面可了解大鼠的死亡原因，另一方面也可对大鼠的解剖进一步熟悉，为正式实验提供经验。手术结束后24～48 h为大鼠存活的关键时期，如何能在这段时间提高大鼠存活率也是需要解决的问题。总之，用线栓法制备脑缺血模型前，需设想实验中遇到的多种可能情况及各个环节对模型的影响，参考相关文献对问题进行探索；实验时，提高造模者手术熟练程度及尽量避免破坏血管等；术后，对大鼠进行护理，可提高模型复制成功率，为后期实验奠定基础。