外泌体：肝纤维化中药调控新靶标*

杨悦，唐露露，魏涛华，，郝文杰，钱南南，杨文明，3

1 安徽中医药大学研究生院 安徽合肥 230038

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

3 新安医学教育部重点实验室 安徽合肥 230038

肝纤维化是在各种致病因素作用下导致的以细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）过度沉积为病理特征的一种慢性肝病，其发病机制与多种细胞因子以及多种信号传导途径有关，早期若不能得到很好的控制，病情迁延不愈日久可发展为肝硬化甚至肝癌。流行病学显示，肝纤维化的发病率逐年增加，已经成为全球重要的公共卫生负担。迄今为止，尚无特效疗法可用于肝纤维化的治疗。因此，深入肝纤维化机制研究和加速抗肝纤维化药物研发显得尤为重要。外泌体作为近年来的研究热点，越来越多研究证实外泌体参与肝纤维化形成的病理生理过程，可能是调控肝纤维化进程的重要靶标。

外泌体（Exosome）是一类特殊的细胞外囊泡，直径在 30～100nm，可携带核酸、蛋白质、脂质、细胞因子和其他生物活性物质，是细胞间传递的重要物质。大部分哺乳动物细胞都会产生外泌体，并且不同细胞分泌的外泌体的组成或数量会有所不同，具有高度特异性。在人体内，外泌体可广泛存在于唾液、血清、血浆和尿液等体液中。1983 年，Johnstone 等人首先在绵羊网织红细胞的培养过程中发现外泌体[1]。起初，外泌体具有脱落膜蛋白作用，用于处理废弃蛋白质和其他分子[2]。直到1996 年，Raposo 等人报告外泌体参与抗原呈递和适应性免疫反应[3]，促使外泌体重新受到研究者们的关注和重视。

研究发现，外泌体的发生与多囊泡内体途径密不可分，外泌体的发生包括早期内体形成、晚期内体形成和多囊泡形成。多囊泡可转运到溶酶体中进行溶酶体胞吐作用，或与内体膜融合，然后将脂质体释放到细胞外空间，蜕变成外泌体[4]。报道显示，外泌体可调节多种病理生理反应，例如炎症反应、免疫应答、免疫逃逸等。外泌体可以包含有价值的生物标志物，对疾病临床的治疗具有强大的潜力。随着对外泌体的研究不断深入，现在已经有大量文献研究证实外泌体与肝纤维化的关系密切。本文以肝纤维化为研究目标，以外泌体为导向，对外泌体调控肝纤维化相关进展作一综述，为中药靶向调控外泌体治疗肝纤维化提供理论基础。

外泌体对肝纤维化发生的调控作用

肝纤维化形成是肝脏对反复损伤后伤口愈合反应的过程，该过程与炎症反应后ECM 的沉积有关。ECM 形成是一个复杂的过程，涉及包括免疫细胞在内的肝实质细胞和非实质细胞，它们起着双刃剑的作用，不仅可以促进肝纤维化的发展，也能有助于肝纤维化的消退。肝纤维化即是机体对肝损伤后的修复反应，是多种细胞因子参与、多种信号介导的动态过程，是各种慢性肝病的共有病理改变。

慢性损伤后，肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）激活，转化为成肌纤维细胞样细胞，活化的HSCs 在组织修复部位迁移并积聚，产生大量ECM 并调节ECM 降解。简而言之，HSCs 的活化是肝纤维化形成的关键环节，增殖的HSCs 通过分泌胶原蛋白而促进ECM 的积累，导致肝纤维化的发生。而外泌体可以通过靶向传递活性物质到HSCs，并参与HSCs 的活化、增殖、迁移及凋亡过程，进而调控肝纤维化的进程。

1 肝实质来源外泌体

实质细胞，也称为肝细胞，约占肝脏总体积的80%，具有排泄胆汁、合成糖原、解毒等作用。肝细胞可以释放外泌体，并且释放的外泌体在肝细胞与肝细胞的通讯以及肝细胞与HSC 的通讯中均具有重要作用。研究发现，外泌体通过整联蛋白配体纤连蛋白整合素粘附和触发鞘氨醇激酶1（Sphingosine kinase1，SK1）反应，调节HSCs 信号传导和迁移[5]。肝细胞分泌的外泌体直接与靶细胞融合，并转移中性神经酰胺酶和鞘氨醇激酶2（Sphingosine kinase2，SK2），导致靶细胞内鞘氨醇-1-磷酸酯（Sphingosine-1-phosphate，S1P）的合成增加，促进肝脏修复和再生[6]。

Devhave[7]等人研究发现与健康志愿者和非丙型病毒性肝炎（Hepatitis C virus，HCV）相关肝纤维化患者相比，在HCV 感染的肝细胞和慢性肝炎纤维化患者血清中外泌体中miRNA-19a 均呈高表达。进一步结果表明，来自HCV 感染的肝细胞的携带外泌体miRNA-19a，并通过调节SOCS-STAT3 轴来激活HSCs，阻止肝纤维化。在砷诱导的肝纤维化模型中发现肝脏中存在MALAT1 的过度表达，肝细胞的外泌体MALAT1 通过miRNA-26b 调节COL1A2 诱导HSCs活化，参与纤维化产生[8]。Lee[9]等人发现棕榈酸处理过的肝细胞衍生的外泌体可诱导HSCs 活化，提示外泌体可能在通过调节肝细胞与HSCs 之间的通讯影响肝纤维化进程。Zhang[10]等人研究发现与非纤维化组织相比，人肝纤维化组织表达的TRIB3 和选择性自噬受体SQSTM1/p62（螯合体1）水平更高，并且在纤维化组织中TRIB3 和SQSTM1 的表达升高呈正相关。TRIB3 介导的自噬损伤不仅抑制晚期内体的自噬降解，而且促进肝细胞分泌富含INHBA/Activin A 的外泌体，从而引起肝纤维化的效应细胞（即HSCs）的迁移，增殖和活化。

2 肝非实质细胞来源的外泌体

非实质细胞包括HSCs，肝窦形内皮细胞，肝巨噬细胞以及胆管细胞，虽然非实质细胞总数只占肝脏细胞总数一小部分，但是它们在肝脏生理病理过程中发挥着不容忽视的作用。这些非实质细胞释放各种物质来通过分泌外泌体调节或辅助肝细胞或邻近的非实质细胞的功能，促进肝损伤后的肝脏重塑。

在肝纤维化过程中存在结缔组织生长因子2（Connective tissue growth factor，CCN2）过表达，CCN2 促进HSCs 的许多分化功能，包括有丝分裂、趋化性、粘附、活化和成熟。HSCs 衍生的外泌体CCN2通过Twist1/miRNA-214/CCN2 纤维化信号轴间穿梭于细胞间，向细胞外转运和递送至靶细胞。HSC 负责miRNA-214 的细胞间穿梭，而miRNA-214 是HSCs中CCN2 依赖性纤维发生的调节剂。miRNA-214 通过外泌体从HSCs 供体细胞向相邻的受体HSCs 或肝细胞进行细胞间转运，随后对CCN2 3’-UTR 进行调节。外泌体miRNA-214 通过靶向递送至活化的HSCs，降低内源性CCN2 表达，抑制α-SMA 的表达，改善肝纤维化程度[11-12]。

HSCs 中外泌体可以通过介导的TLR3 激活IL-17A，IL-1β 和IL-23 的产生，触发γδT 细胞产生强大的IL-17A。此外，外泌体介导的TLR3 激活增加HSC 中CCL20 的表达，从而导致CCR6 +γδT 细胞的募集，加剧肝纤维化进程[13]。研究表明，HSCs 中的miRNA-199a-5p 可以通过靶向抑制CCN2 3'-UTR 活性，降低纤维生成基因表达[14]。另有研究表明，在肝纤维化小鼠中以及体外TGF-β1 诱导的活化的HSCs外泌体中miRNA-30a 存在显著下调，miRNA-30a 通过直接靶向其3'-UTR 区，抑制Beclin1 介导的自噬，阻止细胞外基质过度积累，减轻了纤维化程度[15]。

HSC 是肝纤维化的主要效应细胞，已发现多种lncRNA 在HSC 的激活中起重要的调控作用。原发性胆汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）属于自身免疫性肝病中的一种，研究发现，来自PBC 的异常外泌体在抗原呈递细胞的不同亚群中选择性诱导共刺激分子的表达[16]。lncRNA-H19 是父系印迹的母体表达的lncRNA，在胚胎发育过程中高度表达，但出生后迅速下调。最近，越来越多的研究表明，H19 广泛参与了各种器官纤维化的病理机制。研究发现，在PBC 患者及小鼠模型中，H19 水平与肝纤维化的严重程度密切相关[17]。H19 由胆管细胞衍生，可通过促进HSC 分化和激活在胆汁淤积性肝纤维化的进展中起关键作用，可通过抑制肝细胞中小的异二聚体伴侣表达来破坏胆汁酸稳态，从而促进Mdr2-/-小鼠胆汁淤积性肝损伤[18]。进一步研究结果表明，发现胆汁淤积性肝病患者肝脏中S1PR2 和SphK2 的表达上调，且荧光素酶实验证实H19 充当miRNA let-7 的分子海绵，而HMGA2 是let-7 的靶标。简而言之，H19 通过调节S1PR2/SphK2 和let-7/HMGA2 信号轴在胆汁淤积性肝纤维化起关键作用[19]。

另外，有研究表明源自脂多糖处理的THP-1 巨噬细胞的外泌体miRNA-103-3p 可以通过靶向Krüppel 样因子4 促进HSC 增殖并诱导纤维化基因表达增加，促进肝纤维化进程[20]。

3 其他细胞来源外泌体

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能干细胞，具备强大的增殖、免疫调节和自我复制能力，并认为有归巢特质，是一种理想的细胞疗法。人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSC）可以显著恢复AST活性，降低I 型和III 型胶原产生以及TGF-β1 和磷酸化Smad2 表达，通过抑制细胞外基质的产生，保护肝细胞，改善肝纤维化[21]。研究发现，MFGE8 是MSCs 分泌的一种抗纤维化蛋白，可强烈抑制TGFβ信号传导并减少细胞外基质沉积和肝纤维化[22]。源自绒毛膜源性间充质干细胞（Chorionic mesenchymal stem cells，CP-MSCs）的miRNA-125b 抑制Hedgehog信号通路的激活，从而抑制肝纤维化的发生。另外，有研究表明来源于人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，hbmMSCs）的外泌体可以下调Wnt 信号通路中PPARγ、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin 的表达，从而有助于抑制下游基因WISP1、Cyclin D1 的表达，抑制HSCs 活化，从而降低肝纤维化水平[23]。脂肪间充质干细胞来源（Source of Adipose Mesenchymal Stem Cells，AMSC）的外泌体经miRNA-122 的修饰后介导AMSC 与HSCs 之间的通讯，进一步影响miRNA-122 靶基因的表达水平，例如胰岛素样生长因子受体1，细胞周期蛋白G 和脯氨酰4-羟化酶a1，参与HSCs 的增殖和胶原蛋白的成熟[24]。

内皮细胞衍生来源的外泌体富含SK1，SK1 通过与纤连蛋白及整合素结合粘附在HSCs 膜上，并依赖于dynamin-2 途径介导外泌体进入HSCs 内，调节病理性HSC 迁移[25]。而源自自然杀伤细胞的外泌体可显着抑制TGF-β1 诱导的HSCs 增殖和活化，减轻经CCl4诱导后小鼠的肝纤维化程度[26]。

外泌体在肝纤维化治疗中的作用

目前肝纤维化缺乏特异性治疗，新型抗肝纤维化策略的研发成为临床研究的热点。外泌体作为细胞通讯间的重要物质，不仅可以作为潜在生物标志物用于诊断和预后，也可以作为各种疾病的治疗靶标。越来越多的研究揭示了外泌体在肝脏疾病中的作用，在肝纤维化过程中，外泌体可以通过介导细胞之间的通讯发挥作用，提示外泌体可能是临床潜在的治疗靶标。

MSCs 分泌的外泌体是一种新型的无细胞疗法，已经在多种肝病动物模型中报道了MSCs 衍生的外来体的治疗功效，说明可能是治疗肝纤维化的一种新策略[27]。hucMSC 来源的外泌体具有抗氧化和抗凋亡的能力，可以抑制CCl4 诱导的肝纤维化模型小鼠肝组织中8-OhdG、MDA 以及caspase 3 蛋白以及TGF-β 表达[28]。脂肪来源的间充质干细胞分泌的外泌体可以将miR-181-5p 直接靶向Bcl-2 和STAT3 的30-UTR上的潜在结合位点防止结合，选择性转移至受损的肝细胞，激活Beclin-1 启动自噬反应，从而减轻肝脏损伤[29]。miRNA-122 是肝脏中最丰富的miRNA，可调节饮食诱导的肝细胞缺氧诱导因子-1 和波形蛋白的表达，可能在脂肪性肝纤维化中发挥作用[30]。通过慢病毒介导的pre-miRNA-122 转移构建miRNA -122修饰的AMSC-122，AMSC-122 表达高水平的miRNA-122，并且可仍保留其表型和分化潜能，可以更有效地抑制HSCs 的增殖和胶原蛋白的成熟。结果表明，采用miRNA-122 修饰是治疗肝纤维化的新潜在策略[24]。采用TNF-a 预处理急性肝衰竭中脐带间充质干细胞衍生的外泌体可通过上调miRNA-299-3p，抑制NLRP3 途径的激活来减轻急性肝衰竭引起的炎症损伤并促进肝组织修复[31]。另外有研究表明，正常健康个体的外泌体miRNA-34c、miRNA-151-3p，miRNA-483-5p、miRNA-532-5p 和miRNA-687 具有抗纤维化作用[32]。

根据肝纤维化病理特征和临床表现，中医将其归集在“积聚”“黄疸”“胁痛”“腹痛”等病证范畴。其基本病机为“虚损生积”，其中“积”指的是血瘀，其主要表现为纤维结缔组织的过度沉积，并认为“血瘀为肝硬化之体”，活血化瘀是治疗肝纤维化的基本原则[33]。大量的研究表明，中医药在防治肝纤维化上具有独特优势。研究显示姜黄具有良好的行气活血功效，临证使用广泛。姜黄素是姜黄的的主要活性成分，具有抗炎、抗癌以及免疫调节等作用，大量研究证实姜黄素可通过调节肝组织中多种通路信号转导，促进肝脏修复、缓解肝脏损伤[34，35]。在体内胆管结扎诱导的纤维化模型大鼠中，姜黄素可通过下调miRNA-21，上调miRNA-122，从而抑制TGFβ1表达，阻止肝纤维化进程[36]。在体外HepG2 和HCCLM3 细胞模型中，也证实姜黄素治疗可下调miRNA-21 表达，上调TIMP3表达并抑制TGF-β1/smad3 信号通路，发挥保护肝脏作用[37]。血瘀既是肝纤维化的病理产物，也是导致肝纤维化的致病因素。因此，活血化瘀法应贯穿本病治疗的始末。《妇人明理论》云：“一味丹参散，功同四物汤”。丹参味苦性微寒，功善活血祛瘀，破癥除瘕。而“虚”主要表现在气血、阴精等方面，反映了人体脏腑功能的损伤与降低。黄芪作为补气药物之首，其性微温味甘，功善益气健脾。黄芪联用丹参是临床治疗肝纤维化的主要药对之一，现代研究显示，黄芪、丹参以及其有效成分具有良好的抗肝纤维化作用。在体内二乙基亚硝胺大鼠中诱导的肝癌（Hepatic carcinoma，HCC）动物模型和体外TGF-β1刺激的HepG2 细胞模型，复方黄芪和丹参提取物通过介导miRNA-145/miRNA-21 和Smad3 磷酸化的相互作用，抑制HCC进程[38]。青蒿素是从中药青蒿中提取的一种化合物，其具有良好的抗疟性。近年来，青蒿素类衍生物对免疫性肝损伤的保护作用逐渐成为关注的热点，双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）可以减少小鼠肝组织中的TGF-β1和TNF-α 的含量来发挥抗肝纤维化作用[39]。DHA 可以通过抑制了 lncRNA-H19 的表达水平，调控HSCs 脂滴代谢发挥抗肝纤维化作用[40]。最新研究表明，lncRNA-H19、Meg3、以及Snhg18 也是肝豆状核变性又名Wilson 病（Wilson’s disease，WD）的TX 小鼠肝脏组织中差异表达的关键lncRNA[41]。而肝纤维化几乎是每一个WD 患者主要肝脏病理改变，是进展至肝硬化的必经阶段。早期干预肝纤维化的进展变得尤为重要，阻断和延缓肝纤维化的发展是治疗WD 的重要策略。杨文明总结得出WD肝纤维化“肝肾亏虚、痰瘀互结”的病机理论，并针对这一病机创制了中药复方肝豆扶木汤。肝豆扶木汤作为WD 肝纤维化的临床效方[42]，前期结果表明，其对TX 小鼠肝纤维化具有逆转作用[43]。因此，我们推测上述基因可能是肝豆扶木汤作用的关键靶点。

结 语

目前肝纤维化治疗的基本策略主要是采用去除病因联合抗肝纤维化治疗，由于肝纤维化病理机制复杂，西药靶点作用单一，临床疗效有限，新型抗肝纤维化药物的研发成为我们亟待解决的问题。外泌体由双层脂质囊泡构成，可由多种细胞释放，并且可以携带多种物质，具有良好的靶向性和稳定性，能够通过特定的信号通路介导与靶细胞结合。因此，采用外泌体进行治疗是一种有前景的调节肝纤维化相关途径的手段。外泌体作为细胞通讯间的重要物质，是近年来医学界研究的热点。越来越多研究证明，外泌体在慢性肝病生理病理过程中发挥重要作用，可能是中药调控肝纤维化的重要靶标。