赖氨酸特异性脱甲基酶2B与p21在卵巢癌组织中的表达及其临床意义*

侯海瑞，杨慧兰，苏善恒，谭彩春，况 燕，易叶叶，黄俊宁，刘婷基

（广西医科大学第一附属医院妇产科，南宁 530021）

在全球范围内，卵巢癌是女性第七大常见癌症和第八大常见癌症死亡原因，5年生存率低于45%[1]。因其缺乏特异性筛查手段，早期诊断困难，发现已是中、晚期，治疗难度大，易复发的特点，严重影响着女性的生命健康。因此，探索卵巢癌的发生发展机制，寻找新的特异性靶点来提升卵巢癌早期诊断和改善预后，降低患者死亡率刻不容缓。

细胞增殖和死亡(凋亡)的失衡必然导致肿瘤的发生。p21是一种成熟的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，被发现在控制细胞周期进程中发挥重要作用[2]。一些证据发现肿瘤发生与p21 蛋白改变之间的联系[3]。赖氨酸特异性脱甲基酶2B(lysine-specific demethylase 2B,KDM2B)，是通过影响组蛋白甲基化的状态对其靶基因进行表观遗传调控，在多种肿瘤中起促癌作用。KDM2B 与p21 均在不同程度上对肿瘤的发生发展起作用。尽管p21已在卵巢癌中得到研究，但其作为预后指标的作用仍然存在着争议[4-5]。然而，KDM2B与p21在卵巢癌中的关系尚不清楚。本研究旨在观察KDM2B 和p21 在不同病理类型卵巢组织中的表达情况，分析两者之间的相互关系及与卵巢癌临床病理特征的相关关系，为探索卵巢癌的发生发展机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年4月至2020年4月在广西医科大学第一附属医院进行诊治的112例卵巢疾病患者的卵巢组织标本，包括20例正常卵巢组织（来源于患子宫肌瘤、子宫腺肌病行全子宫双附件切除术的患者），33例良性卵巢组织（14例黏液性囊腺瘤、19例浆液性囊腺瘤），53例上皮性卵巢癌组织（30例浆液性腺癌、23例黏液性腺癌），6例非上皮性卵巢组织（3例透明细胞癌、3例性索－间质瘤）。所有病例在取材前均未接受药物、放化疗等特殊治疗，并经过组织病理学检查明确诊断。本研究经过本院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒购自美国Axygen公司；逆转录试剂购自Takara公司；荧光染料SYBR Green 购自Throme公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；KDM2B 兔多克隆抗体（SAB 公司，批号：47690）；p21兔单克隆抗体（Abcam公司，批号Ab109520）；SP 试剂盒（博士德生物公司，批号：SV0002）和DAB 显色试剂盒（博士德生物公司，批号：AR1022）。

1.3 免疫组化法检测卵巢组织KDM2B和p21表达 实验过程严格按照试剂使用说明书进行。其中KDM2B及p21抗体工作液分别为1∶50和1∶100，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。最终在显微镜下观察结果。KDM2B阳性定位为细胞核和（或）胞质内出现棕黄色褐色颗粒，其他着色程度强度明显高于背景非特异性染色即定义为阳性表达；p21 阳性定位为细胞核成强烈且广泛的颗粒状染色时认定p21染色阳性。在光学显微镜下，每张切片随机取5个视野，每个视野根据染色强度计分和阳性细胞百分比。染色程度评定：不着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。阳性细胞百分比评定：＜2.5%为1分，2.5%～50%为2分，50%～70%为3分，＞75%为4分。最后将染色程度和阳性细胞百分比相乘作为最终判定结果：0分为阴性（－），1～4分为弱阳性（+），4～8分为中度阳性（++），8～12分为强阳性（+++）。其中+、++、+++均为阳性表达。

1.4 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测卵巢组织KDM2B 和p21 表达 取40 mg组织标本于液氮中研磨，根据RNA 提取试剂盒说明书提取组织中总RNA，用Nandrop2000检测RNA浓度及纯度后按照逆转录说明将RNA逆转录为cDNA，以β-actin为内参，在Applied Biosystems 7300 PCR 仪上进行检测。引物序列如下：KDM2B 上游：5’-ACTGTGGTAGACCTGGTGGACTG-3’，下游：5’-AATGGCGTTCGTGGCTTCTGTC-3’；P21 上游：5’-GCCCGTGAGCGATGGAACTTC-3’，下游：5’-CCTGCCTCCTCCCAACTCATCC-3’；β-actin 上游：5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3’，下游：5’-GGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’。PCR 反应体系20 μL：cDNA 模板2 μL，上、下游引物各1 μL、SYBR Green Master 10 μL、RNA-free H2O 6 μL。采用2-△△Ct法计算KDM2B、p21 基因相对表达量。实验重复3次。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计数资料以百分率（%）表示，率的比较采用χ2检验，采用Spearman相关系数进行相关性分析；计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同卵巢组织中p21和KDM2B蛋白表达阳性率比较 卵巢癌组织中KDM2B蛋白阳性表达率高于正常卵巢组织、良性卵巢组织，p21蛋白阳性表达率低于正常卵巢组织、良性卵巢组织（均P＜0.05），见表1、图1。

表1 不同卵巢组织中p21和KDM2B蛋白表达阳性率比较 n(%)

2.2 不同卵巢组织中p21 mRNA和KDM2B mRNA的表达情况 恶性卵巢组织p21 mRNA表达水平低于正常卵巢组织、良性卵巢组织；KDM2B mRNA表达水平高于正常卵巢组织和良性卵巢组织（均P＜0.05），见图2。

2.3 p21和KDM2B蛋白表达与卵巢癌临床病理特征的关系 p21在低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴结转移的卵巢癌组织中的表达阳性率低于中、高分化、FIGO 分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移（P＜0.05），而KDM2B 蛋白表达情况相反（P＜0.05）；不同年龄段p21 和KDM2B 蛋白表达阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.4 卵巢癌中KDM2B与p21蛋白表达的相关性

在卵巢癌组织中KDM2B 与p21 蛋白表达呈负相关关系（r=－0.978，P=0.000）。

图1 免疫组化检测不同卵巢组织中p21和KDM2B的表达情况

图2 qPCR检测不同卵巢组织中p21和KDM2B mRNA的表达情况

表2 p21和KDM2B蛋白表达与卵巢癌临床病理特征的关系 n(%)

3 讨论

卵巢癌是世界上最致命的妇科恶性肿瘤[6]。其高死亡率的原因主要是卵巢癌在最初发现时已是晚期且有转移和发展为化疗耐药性的特点[7]。尽管，外科手术和化疗药物有了很大的进步，但患者的死亡率仍得不到改善。

p21在正常细胞中作为细胞周期抑制因子和抗增殖效应因子发挥作用，在一些癌症中发挥异常调控作用[2]。p21 可以通过参与多种信号途径来影响癌症的放疗效果，其功能在癌症中的复杂而重要的作用成为癌症治疗的靶标[8]。p21的下调或者失活，导致正常细胞周期调控失调，细胞增殖增加，并导致恶性肿瘤[9]。有研究表明在催乳素瘤中，降低p21能够使肿瘤的增殖和迁移增加[10]；在食道癌中，p21作为细胞周期激酶抑制剂，通过p53 依赖性途径来可以调节细胞周期进程[11]。但有证据表明，在其他肿瘤类型(如甲状腺癌或子宫内膜癌)中，情况恰恰相反[12-13]。因此，p21 可以是一种致癌蛋白，也可以是一种抑癌蛋白，这取决于其在细胞质或细胞核中的定位[14-15]。本研究中，免疫组化的结果显示，p21蛋白在恶性卵巢组织中的阳性表达率低于正常卵巢组织、良性卵巢组织（P＜0.05）；且p21 蛋白阳性表达率随着肿瘤组织分级及FIGO分期的增加反而表达降低（P＜0.05），有淋巴结转移的阳性表达较低（P＜0.05）。qPCR 结果表明，在mRNA 水平上，p21在恶性卵巢组织中的表达比在正常卵巢组织和良性卵巢组织中的表达的要低（P＜0.05）。这一结果提示p21可能在卵巢癌的发生发展中起着一定的作用。

表观遗传调控主要包括非编码RNA的DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、核小体定位和转录后基因调控[16]。组蛋白甲基化是最常见的组蛋白修饰，在调节基因转录中具有高度动态性[17-18]。此外，组蛋白甲基化既可以激活基因表达，也可以抑制基因表达，这取决于组蛋白甲基化位点[19-20]。KDM2B是一种重要的组蛋白赖氨酸去甲基酶，又称JHDM1B/FBXL10/ NDY1，是一种保守且广泛表达的核蛋白。它靶向H3K36me2 和H3K4me3 去甲基化[21-22]。它参与细胞衰老、细胞分化和干细胞自我更新等细胞正常过程的许多方面[23]。据报道，KDM2B 在急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓系白血病（AML）、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和膀胱癌中表达显著升高[24-28]，且与肿瘤分级呈正相关关系。而且，KDM2B在基底样三阴性(ER-、PR-和Her2-)乳腺癌中高表达，并且是其一个不良预后因子[26]。KDM2B 在胃癌中也是高表达的，被作为预后较差的危险因素[29]。在本研究中，免疫组化结果显示，在恶性卵巢组织中，KDM2B 的蛋白阳性表达率高于正常卵巢组织和良性卵巢组织(P＜0.05)；qPCR 的结果也表明，KDM2B 在恶性卵巢组织中的表达高于正常卵巢组织和良性卵巢组织(P＜0.05)，且随着组织学分级和FIGO 分期的增加而升高(P＜0.05)，有淋巴结转移高于无淋巴结转移(P＜0.05)。与Wang 等[30]在脑胶质细胞瘤中的研究结果相一致。本实验结果表明，KDM2B 在卵巢癌的发生发展中起着一定的作用，然而KDM2B 在卵巢癌中的作用机制及发展预后仍需进一步研究。

P21 是一种周期蛋白依赖性激酶抑制剂，通常通过p53相关途径诱导、调控细胞周期的进程，进而影响细胞增殖和凋亡，两者失去平衡将导致肿瘤生成。KDM2B 是一种组蛋白去甲基化酶，有研究表明，抑制KDM2B 表达促进胶质瘤细胞系的细胞周期进程，导致G0/G1期细胞百分比上升，而S期细胞百分比下降。另外，沉默KDM2B 可以增强p21 蛋白的表达，降低cyclin D1的表达[30]。在多种癌细胞中，cyclin D1 是一种促癌基因蛋白，在细胞周期中调控g1-s 期的转变[31]。这些结果表明，KDM2B 与p21可能通过调节细胞周期相关因子来影响细胞增殖和凋亡的平衡，进而导致肿瘤的生成。本研究结果表明，p21 在卵巢癌组织中低表达，KDM2B 在卵巢癌组织中高表达，p21和KDM2B分别参与卵巢癌的发生发展。本研究还发现，p21与KDM2B呈负相关关系（P＜0.05），因此推测KDM2B 与p21 互相作用共同参与卵巢癌的发生发展，两者可能通过调节细胞周期相关因子进而使细胞增殖和凋亡失去平衡而导致肿瘤的生成，可能成为卵巢癌靶向治疗及判断预后的参考指标。

综上所述，在卵巢癌组织中，KDM2B 与p21 呈负相关关系，KDM2B 在卵巢癌中高表达，p21 在卵巢癌中低表达，两者可能以不同的方式共同参与卵巢癌的发生发展。这可能成为治疗卵巢癌的新方向，扩宽了卵巢癌治疗的新思路。KDM2B和p21在卵巢癌中的发展机制有待进一步研究。