大黄酸衍生物4B诱导内质网应激触发顺铂耐药卵巢癌细胞凋亡的活性研究*

赵玉华 ，李俊莹，王春苗，翟利娜，李欣晓，侯华新，黎丹戎,△

（广西医科大学1.肿瘤医学院；2.药学院；3.生命科学院，南宁 530021）

卵巢癌是妇科肿瘤中发病率和病死率均较高的一类肿瘤，预后差，5年生存率不到30%[1]。卵巢癌高病死率的重要原因是化疗耐药，顺铂是卵巢癌临床治疗的一线药物，然而顺铂耐药的发生给卵巢癌患者的治疗带来了极大挑战[2]。因此，寻找治疗卵巢癌顺铂耐药的新型化合物，提高卵巢癌临床化疗效果迫在眉睫。

内质网应激是细胞内的一种生理反应，适度的内质网应激可以保护细胞，而持续严重的内质网应激则可导致细胞死亡，同时严重的内质网应激会由于内质网的扩张、肿胀而观察到细胞质出现大量空泡[3-4]。内质网应激在多种肿瘤中可被高度诱导，且与肿瘤细胞生存和抗癌治疗耐药相关[5-6]。新近研究指出，激活内质网应激可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活而逆转卵巢癌细胞化疗耐药[7]。但目前尚缺乏调控内质网应激与人卵巢癌顺铂耐药发生、发展关系的研究。本课题组前期合成的系列大黄酸衍生物，其中衍生物4B作用顺铂耐药卵巢癌细胞后发现其细胞胞浆广泛空泡化，细胞生长受到抑制。为进一步明确大黄酸衍生物4B 杀伤顺铂耐药卵巢癌细胞是否与激活内质网应激有关，激活内质网应激是否能作为克服顺铂耐药卵巢癌的治疗方式，本研究以卵巢癌细胞株SKOV3 和耐药株SKOV3/DDP 细胞为研究对象，探讨大黄酸衍生物4B 对卵巢癌细胞内质网应激调控及抑制卵巢癌顺铂耐药细胞增殖的相关机制，以期为顺铂耐药卵巢癌的治疗提供新思路和候选药物。

1 材料与方法

1.1 细胞 卵巢癌细胞株SKOV3、顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDP、正常卵巢细胞株IOSE80 均购于中国医学科学院肿瘤研究所，由广西医科大学生命科学研究院传代保存。

1.2 药物和主要试剂 大黄酸衍生物4B[1,8-二苄氧基-9，10-蒽醌-N-（2-二甲胺基）乙基-3-甲酰胺，纯度＞98%]，由广西医科大学药学院提供。一抗葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、内质网类蛋白激酶（PERK）、β-肌动蛋白（β-actin）及荧光二抗单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 MTT 法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，消化、离心，以5 000 个/孔接种于96 孔板中，培养24 h。加药组为含有不同浓度（0～16 μmol/L）的大黄酸衍生物4B的培养基，空白组为体积相同的完全培养基，设置溶剂对照孔（0.1%DMSO）。药物作用48 h后，每孔加入20 μL的MTT，孵育4 h后，弃去孔板中液体，每孔加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO）。振摇10 min 后，用酶标仪（SynergyH1,美国BioTek公司）检测各孔490 nm波长处的吸光度（OD）值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=（加药组OD值－溶剂对照孔OD 值)/空白组OD 值×100%。根据所得OD值计算半数抑制浓度（IC50）。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，消化、离心，用大黄酸衍生物4B 处理SKOV3 和SKOV3/DDP 细胞48 h，根据MTT 结果确定分组药物浓度，分为对照组、4B 2 μmol/L组、4B 6 μmol/L组和顺铂20 μmol/L组。收集上清及消化细胞，用PBS 洗涤两次，并悬浮于100 μL 结合缓冲液，然后加入5 μL Annexin V-APC 和5 μL 7-AAD（BD Biosciences，USA），室温下避光孵育15 min。添加300 μL 结合缓冲液稀释样品。使用BD FACSCaliburTM流式细胞仪、Cellquest软件分析各组细胞凋亡率。

1.5 苏木精－伊红（HE）染色观察细胞形态学变化 将8×104个/mL 细胞悬液接种到已放有高压灭菌盖玻片的6孔板中，每孔2 mL，贴壁培养24 h后，分别加入2 μmol/L 衍生物4B 和不同浓度顺铂（SKOV3 5 μmol/L，SKOV3/DDP 20 μmol/L）处理细胞，并设空白对照组（不加药物），继续培养48 h。依次用苏木精、伊红染色，晾干，封片。光学显微镜下(EVOS FL Auto，美国Life technologies 公司)观察细胞核和细胞质的改变并拍照记录。

1.6 ER-Tracker Red观察细胞内质网的变化 取对数生长期细胞，消化、离心后接种于共聚焦皿中，待细胞贴壁24 h，加入含大黄酸衍生物4B 2 μmol/L的培养基2 mL，48 h后弃上清，用配置好的ER-Tracker Red 预制液置于孵育箱孵育10 min，加入Hochest33342 染色孵育10 min，用HBSS（Ca2+&Mg2+）洗3 次，PBS 洗3 次，弃去缓冲液，加无血清培养基，激光共聚焦扫描显微镜（SP8，德国Leica 公司）下观察、拍照、记录。

1.7 Western blotting 法检测内质网应激蛋白的表达 4 μmol/L大黄酸衍生物4B分别作用于SKOV3和SKOV3/DDP细胞不同时间（0 h、12 h、24 h、48 h）后，提取细胞总蛋白，BCA 定量，取30 μg 蛋白样品上样，电泳，转膜，封闭，含5%脱脂牛奶的PBST 孵育1 h，一抗GRP78（1∶1 000）、PERK（1∶1 000）、βactin（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，PBST 洗涤3 次，荧光二抗（1:15 000）室温避光孵育1 h。使用Odyssey红外扫膜仪（CXL，美国LI-COR公司）扫描蛋白条带，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin 蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白表达量。

1.8 观察内质网抑制剂4-PBA 对细胞空泡及存活率的影响 取对数生长期的SKOV3 和SKOV3/DDP细胞，消化、离心，以5 000个/孔接种于96孔板中，培养24 h，用不同浓度（0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L）的内质网抑制剂4-PBA 预处理2 h，加入不同浓度的大黄酸衍生物4B（0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L）处理细胞。连续观察拍摄明场下细胞形态学改变。药物作用48 h后，采用MTT法检测细胞增殖率（方法同1.3）。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄酸衍生物4B对细胞的生长抑制作用

SKOV3、SKOV3/DDP、IOSE80 的IC50分别为（3.68±0.71）μmol/L、（3.54±0.37）μmol/L、（5.00±0.18）μmol/L。大黄酸衍生物4B 对SKOV3、SKOV3/DDP 的抑制作用明显强于卵巢正常细胞IOSE80（P＜0.05），说明衍生物4B 对卵巢癌细胞具有一定程度的选择性杀伤作用。

2.2 细胞凋亡 在流式散点图中，右下（lower right，LR）象限表示早期凋亡细胞，右上（upper right，UR）象限表示中晚期凋亡细胞，LR+UR 为总凋亡细胞，结果显示：经2 μmol/L、6 μmol/L 4B 及20 μmol/L 顺铂作用SKOV3 和SKOV3/DDP 细 胞48 h 后，随着大黄酸衍生物4B 浓度的升高，凋亡率升高（P＜0.05），且呈浓度依赖性。药物处理组的总凋亡率高于对照组（P＜0.05），相同浓度顺铂作用两株细胞后，SKOV3 细胞凋亡率明显高于SKOV3/DDP 细胞，表明耐药株确实存在顺铂耐药。在SKOV3/DDP 细胞中，大黄酸衍生物4B 在6 μmol/L时凋亡率高于顺铂20 μmol/L（P＜0.01），且细胞凋亡率呈浓度依赖性升高，见图1。

2.3 HE染色结果 光学显微镜下可见对照组细胞结构完整，细胞核形态完整，细胞质丰富，染色质分布均匀，呈红色均染；顺铂处理后，视野中细胞数减少，胞质皱缩，细胞变细长；衍生物4B处理后，细胞呈不规则形状和皱缩，不同的是，衍生物4B 诱导细胞内胞质空泡的形成，空泡主要分布于细胞核周边，染色质固缩，另外在SKOV3/DDP细胞中衍生物4B引起的空泡明显多于SKOV3细胞，见图2。

2.4 细胞内质网变化 ER-Tracker Red染色结果显示：SKOV3、SKOV3/DDP对照组细胞中（红色）空泡均匀分布于细胞质中，细胞核完整。而当衍生物4B作用48 h 后细胞胞质出现空泡（分布于细胞核周围），且空泡被ER-Tracker Red 标记特异性包围，见图3，表明衍生物4B 诱导的细胞空泡来源于内质网。

图1 衍生物4B对细胞凋亡的影响

图2 细胞HE染色图（×400）

图3 ER-Tracker Red染色定位细胞空泡来源（×630）

2.5 内质网应激相关蛋白的表达 Western blotting结果显示：与对照组（0 h）相比，大黄酸衍生物4B处理后SKOV3 和SKOV3/DDP 细胞中内质网应激标志性蛋白GRP78 和PERK 的表达明显上调（均P＜0.05）；对于SKOV3/DDP 细胞，大黄酸衍生物4B 作用24 h时GRP78上调明显；对于SKOV3细胞，大黄酸衍生物4B 作用48 h 时GRP78 的表达明显增加，见图4。

2.6 内质网应激抑制剂4-PBA对衍生物4B诱导的内质网应激的影响 用0.5 μmol/L 的4-PBA预处理2 h后，加入衍生物4B 2 μmol/L作用24 h后，光镜下可见在4B药物浓度相同的情况下，加入抑制剂组的细胞空泡比不加抑制剂组的明显减少，光镜图如图5A所示。MTT结果测得4-PBA可有效降低衍生物4B 对SKOV3 和SKOV3/DDP 的细胞增殖的抑制作用，使细胞存活率提高，结果如图5B所示。

图4 内质网应激GRP78及PERK蛋白表达

图5 内质网应激抑制剂4-PBA处理后对细胞形态及生存率影响

3 讨论

顺铂作为卵巢癌化疗的经典药物因其效果明确、价格低廉而广泛应用。但糟糕的是，70%的晚期患者经一段时间治疗，顺铂疗效下降甚至消失，2年内发生局部复发并伴有远处转移[8]。卵巢癌的顺铂耐药是导致其高死亡率的主要原因之一，肿瘤发生耐药后，寻找新的对耐药细胞敏感的药物或通过其他途径诱导细胞死亡，对肿瘤的有效控制和治疗至关重要。本研究通过检测衍生物4B 对卵巢癌细胞及正常细胞的IC50发现，衍生物4B 对SKOV3 和SKOV3/DDP 均具有很好抗肿瘤活性，值得注意的是，其对正常卵巢细胞(IOSE80)的IC50相对较高（P＜0.05），表明衍生物4B 对卵巢癌细胞具有一定的选择性。随后流式细胞术检测细胞凋亡发现，随着衍生物4B浓度升高，两株细胞的凋亡率均呈浓度依赖性增加，表明无论是卵巢癌细胞还是顺铂耐药的卵巢癌细胞均对衍生物4B敏感。

Qi 等[9]报道，环匹罗司可通过激活PERK 依赖的内质网应激驱动细胞死亡并克服结直肠癌耐药。Kong 等[10]发现miR-512-3p 通过促进内质网应激诱导的细胞凋亡可以改善视网膜母细胞瘤细胞顺铂耐药的抵抗力。可见，激活内质网应激是肿瘤耐药治疗的新方式。持续的内质网应激会导致细胞发生相应的病理变化，内质网的病理改变实质上为水样变性，主要是细胞内水分的流失，进而细胞内出现细胞质的浓缩，最后内质网腔可扩大从而形成空泡。ER-Tracker Red 是内质网红色荧光探针，可用于活细胞内质网特异性染色[11]。本研究通过HE 染色发现，衍生物4B 作用细胞后最明显的细胞形态学改变就是引起细胞胞质出现大量空泡。因此，为确定衍生物4B作用细胞时引起的胞质空泡来源，本研究采用ER-Tracker Red 对内质网进行了标记染色，发现衍生物4B 诱导的细胞空泡可被ERTracker Red 包围，表明空泡来源于细胞内质网，衍生物4B可引起内质网损伤。

内质网相关蛋白GRP78 是内质网内的分子伴侣，可帮助蛋白质正确折叠[12]。在内质网应激发生时GRP78 合成会增强，表达明显增加，促进内质网内未折叠蛋白折叠以减轻内质网应激[13]。类蛋白激酶PERK 是一种位于内质网膜的跨膜蛋白，可偶联内质网应激信号，从而抑制翻译[14-15]。内质网应激会增强PERK 活性，使其表达增加[16]。当人体处于生理状态时，PERK 与GRP78 以无活性的复合物形式存在。在应激状态下,PERK 会与GRP78 分离，GRP78会结合错误折叠蛋白或未折叠蛋白[17]。本研究通过Western blotting 检测了内质网应激蛋白GRP78、PERK的表达，结果发现，衍生物4B可明显上调细胞GRP78、PERK 的表达（均P＜0.05），进一步明确了衍生物4B 作用于细胞后激活了内质网应激。同时，通过结合内质网抑制剂4-PBA[18]处理发现，内质网抑制剂4-PBA不仅能有效减少空泡的产生，而且能逆转衍生物4B引起的细胞死亡。推测衍生物4B 是通过激活内质网应激信号通路抑制卵巢癌及顺铂耐药卵巢癌细胞的生长，激活内质网应激或可逆转卵巢癌顺铂耐药，成为卵巢癌细胞顺铂耐药治疗的一个新方向[19]。然而，本研究仍具有一定的局限性，衍生物4B 可诱导细胞产生内质网应激，但其具体通过哪条内质网应激通路对卵巢癌顺铂耐药敏感及药物在体内的作用机制仍有待于进一步研究。