补骨脂素诱导BMSCs成骨分化中的LncRNA表达谱分析

杨锋 李文雄 康武林 董博 袁普卫

陕西中医药大学 陕西高校青年创新团队，陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712046

长链非编码RNA(lncRNA)是近年来发现的重要的表观遗传学调控手段，可多层次调控基因表达，影响干细胞的多能性和发育，从而调控干细胞的分化命运。作者前期研究[1]表明一些补肾中药能通过DNA甲基化、组蛋白去乙酰化等表观遗传学机制显著促进成骨相关基因及蛋白表达。其中，补肾中药补骨脂的有效组分补骨脂素具有较强的成骨作用，可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。已有研究[2]证实多种lncRNA参与了BMSCs 的成骨分化，lncRNA在调节BMSCs增殖与分化方面具有重要作用，与各种骨骼疾病有着密切的关系。但有关中药介导lncRNA调控BMSCs成骨分化的作用机制报道较少。本研究通过lncRNA芯片、生物信息学、Real time RT-PCR等技术筛选出补骨脂素调控BMSCs成骨分化相关的lncRNA，为揭示lncRNA在补骨脂素调控BMSCs成骨分化中的表观遗传学机制奠定基础，从而进一步促进中医“肾主骨”理论的转化应用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取4～6周龄SD大鼠10只，清洁级，雌雄各半，体重(90±10)g，由西安交通大学实验动物中心提供(合格证号：61001700000815)。饲养温度20～25 ℃，相对湿度50 %，全价营养饲料喂养。

1.2 主要试剂及仪器

L-DMEM(Gibco，Invitrogen，USA)、胎牛血清(FBS，Gibco，Invitrogen，USA)、DMSO、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、1-3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛、胰岛素、MTT(Sigma USA)、补骨脂素标准品(Sigma)、Total RNA提取试剂盒(Promega)、RT-PCRKit(Invitrogen，USA)、mRNA引物(华大基因)、胰蛋白酶(Gibco USA)、CO2孵箱(Thermo，USA)、倒置相差显微镜(Olympus)、Bechman Epicx流式细胞仪、水平式电泳仪(Bio-Rad，Hercules，CA)、凝胶成像分析系统(Dolphin DOC，Wealtec，USA)、PCR 仪(Rotor-Gene 3000 Corbett Research，Australia)、酶联免疫标记仪(Bio-Rad 550)。

1.3 BMSC体外培养与鉴定

经戊巴比妥麻醉后，无痛下颈椎脱臼法处死；将大鼠在75 %的乙醇中浸泡5 min，无菌条件下取出股骨和胫骨，切除干骺端软骨显露髓腔，用5 mL注射器吸取L-DMEM培养基反复冲洗髓腔。10 cm培养皿收集骨髓冲洗液，37 ℃、5 % CO2孵箱培养。每3 d换液1次。第4代培养细胞进行流式细胞仪检测，结果显示细胞均一性较好，其中CD34表达呈阴性，而CD90、CD29表达呈阳性，表达率分别为1.4 %、96.4 %和97.5 %，提示培养所得细胞主要是BMSCs，非造血性细胞。同时，经成骨、成脂诱导证实该细胞可以分化为成骨细胞和脂肪细胞。细胞计数并调整细胞浓度至5*104/mL，备用。

图1 BMSCs流式图Fig.1 Flow cytometry chart of BMSCs

1.4 分组与给药

细胞分3组，每组6孔，实验重复3次。

对照组：L-DMEM，10 %FBS，1 %青霉素、链霉素。

成骨诱导组：L-DMEM，20 %胎牛血清，1 %青霉素、链霉素，成骨诱导剂(10-8mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.05 mmol/L L-抗坏血酸)。

补骨脂素组：MTT实验结果(见图2)表明0.01、0.1、1、10 μmol/L均对体外培养的BMSCs具有促进增殖作用，尤以10 μmol/L的作用最为明显，但当浓度达到100 μmol/L时出现毒性反应。故后续实验选择10 μmol/L浓度。

图2 MTT法药物浓度筛选Fig.2 Drug concentration screen with MTT method

1.5 碱性磷酸酶染色

诱导第4天取一6孔板，PBS清洗2遍，加入固定液，10 min后加入底物，37 ℃水浴15 min，水洗；再加入苏木精复染10 min，水洗，晾干后镜下观察。

1.6 BMSCs及其诱导成骨分化中的lncRNA表达谱芯片

收集P2代BMSCs，Trizol一步法提取总RNA，用分光光度计定量。取50～100 μg 总RNA用PEG方法分离lncRNA，用T4 RNA连接酶进行荧光标记。然后再用无水乙醇沉淀。将荧光标记后小分子 RNA 溶于 16 μL杂交液中(15 %甲酰胺、0.2 % SDS、3*SSC、50*Denhardt)，于 42 ℃与Agilent大鼠长链非编码RNA芯片杂交过夜。杂交结束后，先在 42 ℃左右在含 0.2 % SDS、2*SSC 的液体中漂洗 4 min，然后在 0.2*SSC 液体中室温漂洗 4 min，甩干。用Agilent DNA Microarray Scanner(G2505C)进行扫描。用Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1) 生成芯片图，并得到原始数据。

1.7 芯片分析

使用GeneSpring GX v12.1软件(Agilent Technologies)对数据进行Quantile标准化和数据处理。原始数据标准化后经过筛选高质量探针(某探针在12个样品中至少有3个被标记为Present或Marginal)进行进一步分析。两组样品间具有统计学意义的差异表达LncRNA或差异表达mRNA通过P-value/FDR筛选。筛选条件为：FDR控制在5 %以内，Fold change不低于2倍。

1.8 差异性lncRNAs的验证

选取高表达的差异lncRNAs做PCR验证。以GAPDH作为看家基因，差异性lncRNA 作为目标基因，与芯片结果进行印证。

1.9 GO分析和Pathway 分析

运用topGo进行差异lncRNA的GO分析，运用KEGG等生物软件综合分析长链非编码RNA所参与的分子功能和相关信号通路。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 补骨脂素对BMSCs碱性磷酸酶的影响

碱性磷酸酶染色显示补骨脂素组碱性磷酸酶活性较成骨诱导组和对照组明显增强，见图3。碱性磷酸酶阳性细胞胞浆呈现浅灰色、灰黑色颗粒沉着，补骨脂素组较成骨诱导组明显。

图3 三组细胞碱性磷酸酶染色Fig.3 ALP staining in cells of the three groups

2.2 lncRNA芯片

2.2.1三组细胞LncRNA聚类分析(见图4)：用lncRNA芯片获得大鼠BMSCs、成骨诱导及补骨脂素干预21 d后的lncRNAs表达谱。通过各组两两比较，发现差异倍数2倍及以上的共446个lncRNAs。在BMSCs成骨分化过程中，共筛选5个lncRNA显著上调，4个lncRNA显著下调(见表1)。其中XR009483上调最显著，而XR007366下调最显著。

表1 BMSCs成骨分化差异表达的部分lncRNATable 1 Differential expression of lncRNA in the osteogenic differentiation by BMSCs

图4 三组细胞LncRNA聚类分析图Fig.4 Cluster analysis diagram of LncRNA in three groups

2.2.2PCR验证：选取2个差异表达lncRNA，引物序列见表2，其中1个上调 (XR009483)、1个下调 (XR007366)。Real-time PCR结果显示，与对照组比较XR009483显著上调(P<0.05)；XR007366显著下调(P<0.05)，见表3。Real-time PCR验证结果与芯片结果相符。

表2 lncRNA引物序列Table 2 Primer sequences of lncRNA

表3 Real-time PCR检测 BMSCs 成骨分化lncRNA 的表达水平Table 3 The expression level of lncRNA in the osteogenic differentiation by BMSCs detected with RT-PCR

2.2.3GO分析和Pathway 分析：经差异分析(fold change >2,P<0.001，Q<0.05)得到446个差异基因。将差异基因分别进行GO(P<0.01，FDR<0.01)和pathway分析(P<0.05)，富集得到351个GO term和110条pathway。表4为部分GO富集结果，表5为差异最显著的15条pathway。多数为干细胞成骨分化、骨代谢相关的功能类群，如：间充质干细胞分化、骨骼发育、胶原合成、骨矿化等。pathway分析多数为经典信号通路。

表4 部分富集度高的GO termTable 4 Highly enriched lncRNAs in GO

表5 部分富集度高的pathwayTable 5 Highly enriched lncRNAs in the pathway analysis

GO分析结果显示，在生物学进程化(biological process，BP)方面，BMSCs成骨分化过程中持续差异表达mRNA基因中有680个基因富集于生物学进程，其中富集评分较高的是mesenchymal development、skeletal system development及cartilage development等生物学进程,含有差异表达基因208个。在细胞组件(cellular component，CC)方面，富集较高的是extracellular space、extracellular matrix、collagen trimer等组件，含有差异表达基因114个。在分子功能(molecular function，MF)方面，BMSCs成骨分化过程中持续差异表达mRNA基因中有631个基因富集于分子功能，其中富集评分较高的collagen biosynthetic process、bone morphogenesis、ossification及bone remodeling 等分子功能，含有差异表达基因158个。

KEGG分析结果显示，BMSCs成骨分化过程中持续差异表达mRNA基因中有427个基因富集于生物学通路，并主要富集于15个生物学通路，其中富集评分较高的是TGF-beta、Wnt、NF-kappa B及Calcium等生物学通路，含有差异表达基因143个。

续表5 部分富集度高的pathwayContinued table 5 Highly enriched lncRNAs in the pathway analysis

3 讨论

骨创伤、骨坏死、骨质疏松、骨肿瘤等引起的骨缺损修复一直是骨科领域的难题，随着骨组织工程技术的发展，以生物材料与种子细胞的活体移植为代表的组织工程骨修复骨缺损成为一种全新的治疗模式并日益得到广泛关注。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有强大的自我增殖能力以及多向分化潜能，能分泌多种生物活性物质，包括细胞因子、生长因子等，具有改善微环境、抑制局部炎症反应等作用，是骨组织工程理想的种子细胞。但BMSCs的成骨活性受微环境和支架孔隙结构等多因素影响，临床应用受到一定限制。所以，如何维持干细胞的成骨活性成为骨组织工程领域亟待解决的关键问题之一。中医药在“肾主骨”理论指导下应用补肾药物调节干细胞微环境诱导BMSCs的成骨分化，可以增强BMSCs作为种子细胞的成骨活性。补骨脂是常用的补肾壮骨类中药，我们前期研究[3]发现补骨脂素明显上调β-catenin、Runx2基因的表达水平，多项研究[4-5]表明补肾中药补骨脂的有效组分补骨脂素具有较强的成骨作用，可以介导Wnt/β-catenin及BMP/Smad信号通路诱导BMSCs成骨分化，是理想的骨组织工程种子细胞成骨分化诱导剂。

长链非编码RNA在BMSCs成骨分化中的研究日渐增多。已有的研究表明lncRNA对干细胞的自我更新和多向分化起到重要的调控作用。如Takeda等[6]研究发现骨形态发生蛋白2(BMP2)在诱导间充质干细胞成骨分化过程中，lncRNA-BORG表达显著上调，说明lncRNA-BORG参与间充质干细胞的成骨分化。Zhu等[7]发现lncRNA-ANCR与EZH2相互作用后下调Runx2的表达，从而抑制间充质干细胞的成骨分化。Zuo等[8]研究鼠间充质干细胞在早期成骨分化过程中lncRNA的表达谱特征，发现BMP2处理组与对照组相比，有116个lncRNA差异表达。孙翔等[9]利用Agilent lncRNA 芯片筛选出成骨分化前后差异表达的lncRNA，对lncRNA 邻近蛋白编码基因分析表明部分lncRNA(如lncRNA ENST0000058553 7.1 和lncRNA eHIT00001595) 可能在hMSCs 成骨分化过程中发挥重要作用。罗嘉全等[10]研究发现 lncRNA -AK096529 和uc003ups 可能通过正向调控Smurf1，减少Runx2 的降解，从而促进hMSCs 的成骨分化。Liao等[11]研究发现LncRNAH19 可以促进间充质干细胞成骨分化。证明了lncRNA在BMSCs成骨分化过程中发挥着重要的调节作用。但有关lnRNA在中药调控BMSCs成骨分化中的机制研究仍然较少。已有的研究仅表明罗汉果苷V可通过促进LncRNA TUG1表达刺激成骨细胞的增殖与分化[12]。钟梅[13]通过分析lnc RNA在淫羊藿苷(Icariin，ICA)诱导人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)成骨分化前后的差异性表达，筛选出与成骨分化密切相关的lncRNA-p16340和lnc RNA-p21662，它们随着成骨诱导时间的增加，其表达逐渐成上升趋势，提示可能与成骨分化的调控密切相关。并无文献报道lnRNA在中药调控BMSCs成骨分化中的机制研究。

本研究在前期针对补骨脂素诱导成骨过程中基因甲基化、组蛋白乙酰化等表观遗传机制研究的基础上，通过芯片及生物信息学技术发现在补骨脂诱导BMSCs成骨过程中446个差异表达的lncRNA，通过聚类分析及GO分析和Pathway分析共发现10个成骨相关的模块及其mRNA和15条信号通路。可以作为补骨脂素诱导BMSCs成骨的潜在靶点。其中，与成骨相关的差异表达lncRNA是后续研究的重点。结合上述GO分析和Pathway分析结果，与BMSCs成骨分化相关的TGF-beta、Wnt、NF-kappa B、Toll样受体信号通路及钙代谢、矿物质吸收、凋亡、骨重塑等相关的信号分子。从中选择相关的mRNA和信号通路作为lncRNA表观调控机制的切入点，进一步阐明补骨脂素诱导BMSCs成骨分化的作用机制。

芯片及生物学信息分析结果为寻找促进BMSCs成骨分化的表观遗传调控途径提供了基础，后续还需要设计过表达及沉默LncRNA持续观察转染后的间充质干细胞增殖分化的情况,以此来鉴定该LncRNA是否能够影响成骨细胞的分化。并在此基础上明确中药及其有效成分的作用靶点，提高 BMSCs 成骨分化能力，为促成骨中药的研发提供新的思路。