一例Ⅱ型常染色体显性骨硬化症患者CLCN7基因突变分析

杨鹏 李灿 罗小庆 莫奇非 张斌 苏楠 陈林

陆军军医大学大坪医院/战伤组织修复与康复医学研究室/全军军事训练伤防治与康复实验室/骨质疏松与骨发育中心/创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042

骨硬化症(osteopetrosis)，或称原发性脆骨硬化症，又称石骨症、大理石骨病(Marble bone disease)等，该疾病是以骨代谢异常、全身性骨密度增高为主要特点的遗传性骨病[1]。骨硬化症首次报道于1904年，研究人员发现此类骨病的产生与破骨细胞的发育异常以及破骨细胞的功能障碍存在十分紧密的相关性[1-3]。根据临床表型及遗传学特征可分为常染色隐性遗传骨硬化症(autosomal recessive osteopetrosis，ARO)[4]和常染色体显性遗传骨硬化症(ADO)[8]，二者的致病基因已基本阐明；此外，还有一种致病基因尚未明确的骨硬化症为常染色隐性遗传的中间型骨硬化症(intermediate autosomal osteopetrosis，IAO)[5]。其中，ADO根据致病基因和临床表型的差异又可分为2种类型：Ⅰ型(ADO Ⅰ)和Ⅱ型(ADO Ⅱ)。自2009年国内首次报道至今，多项研究表明ADO Ⅱ类型骨硬化是一种较为常见的骨硬化类型，通常认为其发病原因与多通道膜蛋白基因(chloride channel,voltage-sensitive，CLCN)中CLCN7的突变密切相关[6-8]。经过近十几年研究，关于CLCN7基因突变与骨硬化症关系的研究资料日渐完善，章振林等[9]已对二者之间的关系做了详细总结。本研究中我们对一例ADO Ⅱ类型骨硬化症患者的CLCN7基因外显子序列进行测序分析，结合临床表型对该类型骨硬化症病例加以研究。

1 材料和方法

1.1 对象

患者，女，25岁，外院体检时发现骨量增加，为复查来我院就诊。患者无乏力、无骨骼疼痛等症状，否认骨折史。个人史：无特殊。家族史：父母非近亲婚配，其母亲患有骨硬化症(28岁时去世)。查体：步态正常；脊柱和四肢无畸形。进一步对患者进行了双能X线骨密度检测；同时，利用X线对其胸腰椎、骨盆进行检查。实验室检查：对患者进行血常规、血清钙磷、骨代谢指标(甲状旁腺素、骨钙素、血清降钙素、骨碱性磷酸酶、25-羟基维生素D(25OHD)、β胶原特殊序列、总Ⅰ型胶原氨基端延长肽)等进行检测。

1.2 试剂与仪器

外周血收集管(BD，美国)、DNA纯化试剂盒(Promega，美国)、高保真PCR试剂盒(Promega，美国)、琼脂糖 (Biowest，西班牙)、引物 (重庆擎科兴业生物技术有限公司)、PCR仪(BioRad，美国)、电泳仪(BioRad，美国)、凝胶成像仪(BioRad，美国)。

1.3 方法

征得患者及患者父亲同意之后，签署知情同意书，收集临床资料和空腹抽取患者及其父亲的外周静脉血样本，分装保存于-80 ℃超低温冰箱，取1 mL血液样本用DNA抽提试剂盒提取外周血白细胞基因组DNA。同时从样本库中随机选取50个正常人的DNA样本作为对照。针对骨硬化症最常见致病基因CLCN7[8]，利用高保真PCR试剂盒扩增其所有外显子区域。PCR反应体系为50 μL，退火温度根据不同片段大小控制在 55～65 ℃。产物经琼脂糖凝胶电泳确定得到条带清晰、大小正确的产物之后，交由上海天昊生物科技有限公司对产物进行双向测序。测序后对比分析患者与正常人CLCN7外显子区 的差异。

2 结果

2.1 影像及血清学结果

患者X线片显示髋部和股骨骨密度增加，髂骨出现“骨中骨”现象(图1 A，箭头所示)，椎体骨密度增加，成“夹心饼”样(图1B-C，箭头所示)。骨密度结果显示腰椎1～4 Z值为13，股骨颈Z值为7.8，全髋Z值为10(表1)。血常规、肝肾功等无明显异常，骨代谢指标中除25OHD降低外(表2)，其余均在正常范围内。

注：A 患者髋部正位片显示骨密度增加，髂骨表现为“骨中骨”现象，长骨骨皮质增厚；B-C：患者胸腰椎正侧位相显示广泛的骨密度增加，椎体终版增厚高，呈 “夹心饼”征。图1 患者骨骼X线表现Fig.1 X-ray appearance of the bone in the patient

表1 患者骨密度Table 1 Bone mineral density of the patient

表2 患者的生化指标Table 2 Blood biochemical indexes of the patient

通过对该患者CLCN7基因外显子双向测序分析发现，该患者CLCN7基因的9号外显子发生746位碱基C(c.746C>T)纯合错义突变，导致249位脯氨酸变为亮氨酸(p.Pro249Leu)(图2)，50例正常人中均未发现该突变。患者父亲提供的血液样本测序该位点无此类突变。

注：A 正常人CLCN7基因9号外显子测序结果；B 患者CLCN7基因的9号外显子发生c.746C>T错义纯合突变。图2 患者CLCN7基因测序结果Fig.2 CLCN7 sequencing result of the patient

3 讨论

骨硬化症的主要影像学特征为骨密度增高、骨骺增宽，该病理症状常导致不同程度的并发症，给患者生活带来极大的影响。骨硬化症患者即使临床症状较轻也有可能导致骨髓腔变窄，致使骨髓腔容积降低，骨髓含量减少，进而影响造血功能，造成贫血[10]。另一方面，骨量的异常增加，可能会压迫感官神经，导致听力、视力减弱或异常等[11-12]；此外，骨硬化症患者还有可能出现面瘫、颅面部骨结构改变等[13]，严重者还可能导致失明[14]；恶性骨硬化或直接导致骨折[15]。大量研究表明，骨硬化症的生成与发病与破骨细胞生理状态紧密相关，破骨细胞的发育异常以及破骨细胞的功能缺陷都会导致骨硬化症[1-3]。

本报道病例为II型常染色体显性遗传骨硬化症(ADO II)，又称为Albers-Schönberg 病(OMIM 166600)，该病以迟发性和临床表现多样性为主要特征。发病人群在儿童、青少年及成人中均有分布，主要影像学特征是脊柱呈“夹心饼”样和髂翼“骨中骨”表现。虽然ADO II是常染色体显性遗传性疾病，但是其外显率在60 %～90 %之间[16]，发病率极高，对患者身心健康造成极大危害。

CLCN7是导致ADO II的关键基因，人CLCN7基因定位于染色体16p13.3，由25个外显子构成。CLCN7基因编码的氯离子通道蛋白是一种多通道膜蛋白，该蛋白由两个同源单体构成，每个单体含18个α螺旋体，这些α螺旋体中的4个具有氯离子(Cl-)结合位点。该通道蛋白同时也是质子泵，其主要功能是在将Cl-转运到细胞内的同时将氢离子(H+)反向转运到细胞外。CLCN7基因的表达是破骨细胞发挥骨吸收功能的关键，氯离子通道蛋白高表达于成熟破骨细胞褶皱缘和溶酶体的隔室内，通过其转运功能向骨吸收陷窝内分泌H+，使得整个骨陷窝的pH值维持在4左右，通过形成酸性骨吸收陷窝溶解骨基质的方式来保证破骨细胞骨吸收功能的正常发挥。简言之，该蛋白可以通过离子交换的方式把Cl-转运至破骨细胞的小囊泡中的同时将大量H+泵出到骨吸收陷窝中形成能够使破骨细胞发挥骨吸收功能的酸性环境[17]。虽然CLCN7不直接参与溶酶体酸化的过程，但是它可能为构建溶酶体电荷平衡起关键作用[18-19]。有研究表明，在敲除CLCN7基因的小鼠体内会出现骨硬化症表型，实验结果显示，虽然小鼠体内含有正常数量的破骨细胞，但其破骨细胞中的溶酶体积蓄细胞功能异常，破骨细胞吸收陷窝内不能形成适宜的酸性环境供其发挥正常的骨吸收功能[2,19]，直接导致了破骨细胞功能降低。此外，通过siRNA处理的方法干扰CLCN7基因的表达会使溶酶体形成酸性环境的能力减弱，并证明氯离子通道蛋白7可以通过转运Cl-透过溶酶体膜进入溶酶体的方式来促进酸性环境的形成[21]。因此CLCN7基因缺失可导致破骨功能缺陷，进而导致骨硬化症。

本例患者无明显临床症状，X线片显示多个骨骼部位骨密度增加，有“夹心饼”样征和“骨中骨”现象，属于较为典型常染色体显性骨硬化症中的ADO Ⅱ型骨硬化症。实验中对CLCN7外显子测序显示在9号外显子上发生错义突变(纯合突变)，导致p.Pro249Leu，该突变位点位于构成氯离子通道蛋白的α螺旋体中的4个具有Cl-结合位点的α螺旋体中的一个，该突变可能导致氯离子通道蛋白7的Cl-结合能力降低，使得溶酶体的酸化功能异常，导致破骨细胞功能降低，进而引发骨硬化症。比较之前国内外文献中报道的42种与ADO II型骨硬化症相关的CLCN7突变[8-9]，该突变在国内为首次发现并报道。

致病基因的测序检测可以帮助患者及医生及时确诊病情，丰富致病基因谱，为疾病与基因型之间关系的研究提供研究素材。但是，ADO Ⅱ型骨硬化症的基因诊断及报道更是依然较少，致使医生及科研人员无法充分地对该病进行总结分析，寻找相应的预防检测及治疗措施。骨硬化症目前尚无有效的治疗方法，希望通过我们的临床诊断及研究能够为该病症的研究提供一些案例支撑和理论基础，为揭示骨硬化症的机制和治疗措施的研究提供一定的论据。