过表达RNF43抑制肾透明细胞癌细胞系786-O增殖、迁移与侵袭

孙志超，王秀芝，杨舒慧，浦 洋*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生理学系，北京 100005；2.中国科学院北京基因组研究所(国家生物信息中心) 精准医学重点实验室，北京 100020)

肾癌(kidney cancer)是泌尿系统第二常见的恶性肿瘤，目前，占全球成人恶性肿瘤的5%左右，且发病率逐年上升[1]。约80%的肾癌被临床诊断为肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)[2]。大约30%的肾细胞癌患者在初诊时就有转移性病灶[3]。20%～40%的术后病例会发生局部复发[4]。此外，传统的化学药物治疗和放射治疗对肾透明细胞癌的治疗基本无效[5]。因此，迫切需要进一步理解肾透明细胞癌发展和转移的机制，以识别新的生物标志物和开发更有效的治疗肾透明细胞癌的方法。

RNF43是一种E3泛素化连接酶[6]。RNF43缺失能激活Wnt/β-catenin信号通路[6-8]。RNF43在癌发生过程中的促进或抑制作用颇受争议。RNF43在肝癌中起促进作用，而在胰腺癌、胃癌和大肠癌中起抑制作用[7,9-10]。但是RNF43对肾透明细胞癌细胞生物学功能的影响尚不清楚，其是否参与肾透明细胞癌的发生发展，以及其在临床诊断与治疗中的作用有待探究。

本研究重点探讨RNF43对肾透明细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响，为肾透明细胞癌发生的分子机制、诊断和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人肾透明细胞癌细胞系786-O(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 主要试剂：胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)；RPMI1640培养基(Corning公司)；β-actin抗体(Santa Cruz 公司)；β-catenin和 Non-phospho (Active) β-catenin抗体(Cell Signaling Technology公司)；DDK抗体、RNF43过表达质粒和空载质粒(OriGene公司)；抗兔和鼠的荧光二抗(LI-COR公司)；CCK-8 试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Roche公司)；VigoFect 高效真核转染试剂(威格拉斯生物技术有限公司)；无内毒素质粒大提试剂盒(天根生化科技有限公司)；LGK974(Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 TCGA突变数据库分析: 使用Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA)网站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析人肾透明细胞癌组织中的基因表达。

1.2.2 细胞的培养及分组干预：用90% RPMI1640 培养基+10%血清+1%青霉素链霉素双抗配制成的细胞培养基于37 ℃、5% CO2培养786-O细胞。细胞接种于60 mm培养皿(生长面积21 cm2)中，待细胞增殖至70%～80%时，进行RNF43质粒瞬时转染或用Wnt通路抑制剂LGK974处理。

1.2.3 免疫印迹实验：收集相关处理组别的细胞，加入适量RIPA细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，冰上裂解30 min。13 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清总蛋白混合液到一个新的1.5 mL离心管中，用BCA法测定蛋白样品浓度。用5×蛋白上样缓冲液稀释蛋白样品，95 ℃加热10 min使其变性。每组取15～30 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，利用转膜仪将蛋白转移至NC膜上。最后使用Odyssey CLx成像系统对蛋白条带进行检测。利用β-actin蛋白作为内参对照，进行相关组别蛋白表达定量。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖: 取96孔板，每孔加入2 000个细胞，每组6个复孔。待细胞贴壁后第0、24、48和72 h，使用CCK-8试剂盒测定细胞在450 nm波长的吸光度值，绘制细胞增殖曲线，评估细胞活力。

1.2.5 克隆形成检测细胞克隆形成：取6孔板，每孔加入200个细胞，每组3个复孔。10 d后弃去上清，用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗后，用0.1%结晶紫染色15 min，拍照并统计克隆数。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移：取12孔板，将划痕实验插件放入12孔板内，使其紧贴在底部。用完全培养基稀释细胞至浓度为5×105个/mL，并吸取70 μL(约3 500个细胞)加入划痕插件中，每组3个复孔，培养24 h。取出划痕插件，用PBS轻柔漂洗细胞2～3次，然后加入无血清培养基继续培养，分别于 0、10 h在显微镜下观察拍照，测量并统计细胞间的划痕面积。

1.2.7 Transwell小室检测细胞侵袭：取24孔板，每孔加入600 μL完全培养基，放入Transwell小室，在小室中加入200 μL 无血清培养基，稀释浓度为1.5 ×105个/mL细胞悬液，每组做3个复孔。培养14 h后取出Transwell小室，吸去培养基，用PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛固定25 min，PBS洗涤后，用0.1%结晶紫染色20 min，用棉签擦掉上层未迁移细胞。在显微镜下观察并拍照，计数细胞并统计。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 RNF43在人肾透明细胞癌组织中低表达且与预后不良相关

在TCGA数据库中，与正常组织相比，人肾透明细胞癌组织中的RNF43显著低表达，且随着分期的进展进一步降低。RNF43高表达的肾透明细胞癌患者生存时间明显比RNF43低表达患者长。

2.2 过表达RNF43抑制786-O细胞增殖

RNF43过表达细胞与阴性对照组相比，RNF43表达上升，而细胞增殖能力与集落形成能力均明显降低(图1)。

2.3 过表达RNF43抑制786-O细胞迁移和侵袭

与阴性对照组相比，RNF43过表达组的细胞迁移和侵袭能力均明显减弱(图2A,B)。

2.4 过表达RNF43抑制786-O细胞Wnt/β-catenin通路

与对照组相比，RNF43过表达组Wnt/β-catenin通路中，β-catenin和non-phospho (active) β-catenin的表达显著降低(P<0.05)(图3)。

2.5 Wnt抑制剂抑制786-O细胞增殖

Wnt抑制剂LGK974处理786-O细胞后，β-catenin、 non-phospho (active) β-catenin和RNF43的表达显著降低(P<0.05)(图4A,B)。LGK974处理组与对照组相比，细胞增殖能力与集落形成能力均明显降低(图4C,D)。

A.protein level of RNF43 in control and RNF43 over-expression group; B.effect of RNF43 over-express on proliferation of renal clear cell carcinoma; C.effect of RNF43 over-express on clone formation ability of renal clear cell carcinoma; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control group

A.effect of RNF43 over-express on migration of renal clear cell carcinoma; B.effect of RNF43 over-express on invasion of renal clear cell carcinoma; *P<0.001 compared with control group

protein level of β-catenin and non-phospho (active) β-catenin in control and RNF43 over-expression group; *P<0.05,**P<0.01 compared with control group

3 讨论

肾透明细胞癌约占肾脏恶性肿瘤的80%，是全球常见的恶性肿瘤之一[1-2,5]。世界上有超过40万人遭受此病的困扰,造成每年约17.5万人死亡[11]。由于治疗选择有限，治愈晚期和转移性肾透明细胞癌仍然是一个挑战，5年存活率仅为12%[1]。因此，进一步研究肾透明细胞癌发展和转移的机制尤为重要。

A.protein level of β-catenin and non-phospho (active) β-catenin in control and LGK974 treated group; B.RNF43 expression in control and LGK974 treated group; C.effect of LGK974 on proliferation of renal clear cell carcinoma; D.effect of LGK974 on clone formation ability of renal clear cell carcinoma; *P<0.05,**P<0.001 compared with control group

本研究探讨了RNF43在肾透明细胞癌中的表达规律、临床意义和生物学功能，包括对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。RNF43在癌发生发展中的作用颇有争议。先前的报道表明，在肝癌中RNF43可以促进癌的发生发展，在胰腺癌、胃癌和大肠癌中RNF43可以抑制癌的发生发展[7,9-10]。然而，这样一个有趣的基因在肾癌中的作用还未被研究。本研究发现，RNF43在肾透明细胞癌组织中表达降低，且与患者预后不良相关。提示RNF43在肾透明细胞癌中可能起抑癌作用。本研究的细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭实验均证明了这一假设，过表达RNF43抑制了肾透明细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

多项研究表明，RNF43能够抑制Wnt/β-catenin信号通路[6-8]。本研究在786-O细胞中也证明了这一点。为探究过表达RNF43抑制786-O细胞的增殖、迁移和侵袭是否与Wnt/β-catenin信号相关。本研究对786-O细胞给予LGK974处理。LGK974是一种PORCN抑制剂，可以特异性地抑制Wnt蛋白的分泌，并阻断RNF43突变PDAC细胞系来源的小鼠异种移植的生长[7]。该抑制剂目前正在进行1期临床试验(NCT01351103)，用于治疗Wnt配体依赖的恶性肿瘤患者。结果表明，LGK974处理同过表达RNF43带来了一致的效果，即抑制了786-O细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述，本研究首次揭示了人肾透明细胞癌中RNF43下调，且与预后不良相关。RNF43能够通过下调Wnt/β-catenin通路来抑制人肾透明细胞癌786-O细胞的增殖、迁移及侵袭。因此，RNF43可作为肾透明细胞癌预后的指标，且可对RNF43低表达的肾透明细胞癌的患者给予Wnt抑制剂LGK974进行联合治疗。