miR-30a抑制Ang2诱导的大鼠心肌细胞系H9c2自噬

于甜乐，马 晗，吴新华，陈章荣，孙 彪，彭 媛，刘 宏*

(1.大理大学 临床医学院，云南 大理 671000；2.云南省滇东北区域医疗中心 呼吸内科，云南 昭通 657000;3.大理大学第一附属医院 心血管内科，云南 大理 671000；4.云南省跨高原心血管疾病防治工程研究中心，云南 大理 671000； 5.大理大学 跨高原心血管疾病防治研究所，云南 大理 671000)

血管紧张素2(angiotensin2，Ang2)是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽，在体内过量表达给心血管系统带来了不利影响。多项研究[1-2]表明，Ang2诱导的心血管疾病过程中有自噬的参与。细胞自噬本质上是指细胞内异常的细胞器、折叠错误的蛋白质被溶酶体降解为氨基酸等小分子物质并再次利用的过程，是细胞的自我更新和修复的过程。当细胞遭受到饥饿、缺氧、代谢异常等胞内外刺激后，细胞发生自噬，在一定程度上维持细胞内动态平衡，是一种经典的维持细胞生存的机制[3]。自噬的调节与心脏疾病密切相关，参与了包括心肌病、心脏肥大、缺血性心脏病、心力衰竭以及缺血-再灌注损伤等过程。心肌正常运转依赖于基础水平的细胞自噬，但过度自噬会使心肌细胞死亡，加快心血管疾病的发生发展过程[4]。miRNA是内源性(<22个核苷酸组成)单链非编码RNA，与目标mRNA碱基互补配对影响mRNA的稳定性和翻译，参与心肌细胞中多种病理生理过程，对心血管疾病的启动和进展有重要的影响[5]。miR-30a表达与自噬相关，且负向调控自噬[6]。miR-30家族可通过自噬参与心血管疾病相关的心室重构，体外研究发现miR-30a通过下调Beclin-1的表达来抑制细胞自噬[7]。本研究在细胞水平上探讨miR-30a对Ang2诱导的大鼠H9c2心肌细胞自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠心肌细胞系H9c2(上海中国科学院细胞库)；胎牛血清、Opti-MEM培养基和DMEM/高糖培养基(Gibco公司)；反转录试剂盒和RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)；引物、RT试剂和荧光定量PCR试剂(Western Biotechnology公司)；血管紧张素2(Sigma-Aldrich公司)；LC3(兔来源)一抗、Beclin-1(兔来源)一抗和GAPDH(兔来源)一抗(Abcam公司)；山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠IgG二抗(Sigma-Aldrich公司)；羧基荧光素(FAM)标记的miR-30a mimics和miR-30a inhibitor (上海吉玛公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：将H9c2细胞转移至培养皿中，待细胞汇合度达80%时，进行实验。将细胞分为对照组、Ang2(2×10-6mol/L的Ang2配制液)组、NE(5×10-6mol/L的NE配制液)阳性对照组、Ang2+miR-30a mimics组、Ang2+miR-30a inhibitor组、Ang2+miR-NC组。Ang2和NE组均处理48 h，miR-30a mimic、miR-30a inhibitor和miR-NC先转染到细胞中，将H9c2细胞接种至孔板中，把Lipofectamine 2000稀释液和siRNA稀释液轻柔混匀，室温下孵育20 min形成siRNA-Lipofectamine 2000混合物，将混合物加入各孔中后放入37 ℃培养箱中转染6 h，更换完全培养基，培养24 h，转染成功后予2×10-6mol/L的Ang2处理48 h。拍照并收集样本。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-30a mRNA表达：通过GeneBank基因数据库，查询miR-30a mRNA 基因编号并用primer 5.0 软件及Oligo7.0软件设计相关的引物进行合成，生成引物设计序列；抽提总RNA；采用Bio Rad凝胶成像系统曝光采集图片观察条带；测量总RNA浓度及纯度，A260/280在1.8～2.0提示纯度良好，可用于后续实验，A260/230>1表明胍类、酚类等残留较少；U6设置为microRNA的内参。qPCR反应体系配制：预混液(2×)5 μL、正向引物(10 μmol/L)0.5 μL、反向引物(10 μmol/L)0.5 μL、DNA模板去核酸酶水1 μL、去RNA酶水加至10 μL，将qPCR反应液移入96孔PCR反应板中，加入获得的cDNA模板，进行qPCR反应，熔解曲线反应条件：95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

1.2.3 Western blot检测自噬相关LC3、Beclin-1蛋白表达：加入细胞裂解液收集细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配制10% SDS-PAGE分离胶分离蛋白，电泳1.5 h后进行转膜，转膜结束后用1×TBST洗膜1 min，加入5%脱脂牛奶封闭液，于摇床上常温平缓摇动2 h。倒掉封闭液，1×TBST洗膜5 min×3次，分别加入预先稀释好的一抗、二抗(1∶1 000稀释)，于摇床上孵育抗体。设置曝光参数，进行图片采集。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组H9c2细胞中miR-30a mRNA的表达

与对照组相比，Ang2组和NE组miR-30a mRNA表达明显降低(P<0.05)；与NE组相比，Ang2组miR-30a mRNA表达明显降低(P<0.05)(图1)。

2.2 各组H9c2细胞中自噬蛋白的表达

与对照组相比，NE组和Ang2组LC3、Beclin-1自噬蛋白表达显著升高(P<0.001)；与NE组相比，Ang2组LC3、 Beclin-1自噬蛋白表达显著升高(P<0.001)(图2)。

2.3 miR-30a对Ang2引起的心肌细胞自噬的影响

使用末端由FAM荧光标记的miR-30a mimics和miR-30a inhibitor转染24 h后用荧光显微镜(激发波长480 nm，发射波长520 nm)检测转染效率，随机选取心肌细胞转染照片，根据细胞计数，其转染率平均值>70%，说明细胞被miR-30a mimics和miR-30a inhibitor有效转染(图3,4)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with NE group图1 各组H9c2细胞miR-30a mRNA的表达水平Fig 1 Comparison of miR-30a mRNA expression in H9c2 cells of each

细胞经转染处理后使用Ang2刺激，Western blot检测LC3、Beclin-1蛋白表达。相比Ang2组，Ang2+miR-30a mimics组LC3、Beclin-1蛋白表达均显著降低(P<0.05)(图5)。

3 讨论

Ang2与多种心血管疾病密切相关，心脏衰竭过程的Ang2过表达是心室重塑的重要影响因素。ACEI、ARB是以Ang2为作用靶点的药物，能够明确改善心室重塑、降低心血管疾病死亡率[8]，因此，深入探讨Ang2与心血管疾病的内在机制，对寻求有效的药物治疗靶点有重要意义，有研究表明Ang2可能通过诱导心肌细胞自噬参与心血管疾病的发生发展[9]。本研究在体外培养大鼠H9c2心肌细胞，采用2×10-6mol/L 的Ang2诱导H9c2细胞自噬，设立去甲肾上腺素阳性对照组，Western blot检测自噬蛋白LC3、Beclin-1表达水平来判断细胞自噬状态，结果显示特定浓度Ang2能够引起心肌细胞自噬，本部分结果与Ang2相关的心肌细胞自噬结果一致，既往研究显示心肌细胞过度自噬可能加重细胞肥大、纤维化等，是心脏衰竭发病过程中的重要机制，人参皂苷能通过AMPK/mTOR/PI3K途径抑制Ang2引起的心肌细胞自噬[10]，单硝酸异山梨酯、白介素10也能够抑制Ang2诱导的慢性心衰中的心肌细胞自噬过程[11]。

A.the protein expressions of LC3,Beclin-1 was detected by Western blot； B,C.the protein expression of LC3, Beclin-1 was compared in each groups; *P<0.001 compared with control group； #P<0.001 compared with NE group

图3 miR-30a mimics转染组图片Fig 3 Images of miR-30a mimics transfection

图4 miR-30a inhibitor转染组图片Fig 4 Images of miR-30a inhibitor transfection

A.the protein expressions of LC3,Beclin-1 was detected by Western blot; B,C.the protein expression of LC3, Beclin-1 was compared in each groups; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang2 group

有报道[12]表明Ang2处理新生大鼠心肌细胞48 h后细胞中LC3自噬蛋白明显增加，且miR-30a参与细胞自噬过程[13]。本研究通过RT-qPCR检测发现Ang2组miR-30a 基因表达水平较正常组明显下降，并进一步猜测miR-30a可能参与了Ang2诱导的细胞自噬。为了证实miR-30a能够影响Ang2诱导的H9c2细胞自噬，使用miR-30a mimics、miR-30a inhibitor、miR-30a NC转染心肌细胞，发现过表达miR-30a能够抑制Ang2诱导的H9c2细胞自噬。在此过程中，进一步抑制miR-30a，未能进一步增加心肌细胞自噬。既往研究[14-15]已证实miR-30a的靶基因是Beclin-1，可以靶向Beclin-1调控 LC3的表达，影响大鼠心肌细胞缺血再灌注诱导的自噬，从而影响心肌细胞的存活和凋亡。实验中Ang2已经明确抑制了miR-30a表达，使用miR-30a inhibitor未能进一步影响自噬。

综上所述，本研究证实了Ang2能成功诱导H9c2心肌细胞自噬，在此过程中miR-30a表达降低，miR-30a mimics能够抑制Ang2诱导的细胞自噬。当然，Ang2诱导的细胞自噬涉及多条通路、多个靶点，本研究只探讨了miR-30a这一调控因子，因此完整的Ang2相关的自噬通路机制仍需进一步探讨；且miR-30a在Ang2诱导的心血管疾病中可能发挥重要作用，能够成为新的潜在治疗靶点。