儿咳灵糖浆提取工艺优化*

伏东宁，邵 杰

（1.南京中医药大学附属连云港市中医院，江苏 连云港222004；2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港222001）

儿咳灵糖浆由麻黄、苦杏仁、生石膏、黄芩、鲜竹沥等15味中药材制成，是连云港市中医院院内制剂（批准文号为苏药制字Z04000017），具有清肺化痰、止咳平喘功效，用于治疗上呼吸道感染和急性支气管炎引起的咳嗽。目前，缺少工艺指标，无法保证大生产的每批产品的质量稳定。现行制剂工艺中苦杏仁采用温水浸泡24 h后加热蒸馏，收集蒸馏液。文献［1-3］报道，沸水提取比常温浸泡更能提高苦杏仁苷的转移率。本研究中探讨了苦杏仁和麻黄等14味药材提取过程中的主要影响因素，以苦杏仁苷、麻黄碱、黄芩苷的转移率和干浸膏得率为指标性成分，优化儿咳灵糖浆的制备工艺，为其大生产提供参数指导。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DZTW型调温电热套（北京永光明医疗仪器有限公司）；FA1104型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司，精度为0.1 mg）；AS30600B型超声波清洗器（功率为600 W，频率为40 kHz）；Ultimate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试药

麻黄、苦杏仁、黄芩等14味药材均由连云港和兴堂饮片厂提供，经连云港康济大药房连锁有限公司吴舟执业药师鉴定为正品；苦杏仁苷对照品（批号为110820-201303，含量以99.6%计），盐酸麻黄碱对照品（批号为171241-201508，含量以98.6%计），黄芩苷对照品（批号为110715-201418，含量以99.9%计），均购于中国食品药品检定研究院；甲醇和乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 苦杏仁提取工艺优化

2.1.1 正交试验设计［4］

本试验在提取2次的前提下，将药材煎煮方法（因素A）、加水量（因素B）和提取时间（因素C）作为考察因素，在前期预试验基础上，每个因素确定3个水平。以苦杏仁苷含量的3次平均值为考察指标，采用L9（34）正交试验。因素水平见表1。

表1 苦杏仁苷L9（34）正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test for amygdalin

2.1.2 苦杏仁苷含量测定［5］

1)色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：210 nm。理论板数按苦杏仁苷峰计不低于7 000。在此色谱条件下，阴性对照品溶液色谱中，在与供试品溶液色谱相应保留时间处无色谱峰出现，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

2)溶液制备

对照品溶液：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.402 5 mg的溶液，即得。

供试品溶液：按处方比例称取苦杏仁50 g，粉碎成粗粉，按表2中设计水平完成9次试验，合并每次提取液，浓缩至500 mL，作为试验用样品溶液，供含量测定用。精密量取试验用样品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀释，摇匀，定容至100 mL容量瓶中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

表2 L9（34）正交试验设计与结果Tab.2 Design and results of L9（34）orthogonal test

阴性对照品溶液：按照处方工艺，制备不含苦杏仁的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备溶液，即得。

3)方法学考察

图1 苦杏仁高效液相色谱图1.amygdalinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of Semen Armeniacae Amarum

线性关系考察：精密吸取2)项下制备的对照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释，定容，摇匀，得0.040 25，0.080 5，0.161，0.322，0.402 5 mg/mL系列质量浓度的苦杏仁苷对照品溶液。吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按1)项下色谱条件测定。以峰面积（Y）为纵坐标、进样质量浓度（X，mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得苦杏仁苷对照品溶液的回归方程Y=0.068X+0.362（r=0.999 0，n=5）。结果表明，苦杏仁苷质量浓度在0.040 25～0.402 5 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取苦杏仁苷对照品溶液（质量浓度为0.402 5 mg/mL）10μL，按1)项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果苦杏仁苷峰面积的RSD为0.98%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取1号试验样品溶液，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，16，24 h时进样测定。结果苦杏仁苷峰面积的RSD为1.25%（n=7），表明供试品溶液在室温（25℃）条件下24 h内稳定。

重复性试验：取1号试验样品溶液，依法制备供试品溶液6份，按1)项下色谱条件进样10μL测定，记录色谱峰。结果苦杏仁苷峰面积含量的RSD为0.67%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取1号试验样品（苦杏仁苷含量为1.25 mg/mL）9份，各5 mL，按相当于样品中苦杏仁苷含量50%，100%，150%的比例加入苦杏仁苷对照品，平行制备3份，依法制成系列供试品溶液，按1)项下色谱条件进样10μL，测定峰面积，计算回收率。结果苦杏仁苷的平均加样回收率为98.90%，RSD为0.97%（n=9）。

2.1.3 苦杏仁苷转移率计算及工艺验证

精密吸取各供试品溶液10μL，按1)项下色谱条件进样测定，每个样品平行测定3次，计算转移率。苦杏仁苷转移率=(供试品中苦杏仁苷总量/原药材中苦杏仁苷总量)×100%。结果见表2。由表3可见，因素A对试验有显著影响（P＜0.01），因素B、因素C对试验结果无显著影响，各因素对苦杏仁苷含量的影响效果大小顺序为A＞C＞B。最佳提取工艺为A3B1C2，即苦杏仁沸水入药，加6倍量水，煎煮2次，每次1 h。

表3 方差分析结果Tab.3 Rusults of ANOVA

2.2 麻黄、黄芪提取工艺优化

2.2.1 正交试验设计

本试验将加水量(因素A)、提取时间(因素B)和提取次数(因素C)作为考察因素，在前期预试验基础上，每个因素确定3个水平。以盐酸麻黄碱、黄芩苷含量的3次平均值为考察指标，采用L9(34)正交试验。因素水平见表4。

表4 盐酸麻黄碱、黄芩苷L9（34）正交试验因素水平表Tab.4 Factors and levels of L9（34）orthogonal test for ephedrine hydrochloride and baicalin

2.2.2 盐酸麻黄碱含量测定

1)色谱条件［6］与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（3∶97，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：210 nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计不低于3 000。在此色谱条件下，阴性对照品溶液色谱中，在与供试品溶液色谱相应保留时间处无色谱峰出现，阴性对照无干扰。色谱图见图2。

2)溶液制备

对照品溶液：取盐酸麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.520 mg的溶液，即得。

供试品溶液：将2.1.1项下苦杏仁沸水提取过滤后的药渣，按处方比例投入麻黄等13味药材中加水提取，合并煎液，滤过，静置，取上清液浓缩至500 mL，作为试验用样品溶液，供含量测定用。精密量取试验用样品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀释，摇匀，定容至10 mL容量瓶中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按照处方工艺，制备不含麻黄的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备溶液，即得。

3）方法学考察

线性关系考察：精密吸取2）项下盐酸麻黄碱对照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，摇匀，制成系列不同质量浓度的对照品溶液。吸取上述溶液各10μL注入高效液相色谱仪，按1)项下色谱条件测定。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得盐酸麻黄碱对照品溶液的回归方程Y=0.299X+0.205（r=0.999 4，n=5）。结果盐酸麻黄碱进样量在0.520～5.200μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取盐酸麻黄碱对照品溶液10μL，按1）项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果盐酸麻黄碱峰面积的RSD为0.88%（n=6），表明仪器精密度良好。

图2 麻黄高效液相色谱图1.ephedrine hydrochlorideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of Ephedra sinica

图3 黄芩高效液相色谱图1.baicalinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of Scutellaria baicalensis

稳定性试验：取1号试验样品溶液10μL，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，16，24 h时进样测定。结果盐酸麻黄碱峰面积的RSD为0.85%（n=7），表明供试品溶液在室温（25℃）条件下24 h内稳定。

重复性试验：精密吸取1号试验样品溶液，依法制备供试品溶液6份，按1）项下色谱条件进样10μL测定，记录色谱峰。结果盐酸麻黄碱峰面积含量的RSD为1.67%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取1号试验样品（盐酸麻黄碱含量为2.65 mg/mL）9份，各5 mL，按相当于样品中盐酸麻黄碱含量50%，100%，150%的比例加入盐酸麻黄碱对照品，平行制备3份，依法制成系列供试品溶液，按1）项下色谱条件进样10μL，测定峰面积，计算回收率。结果盐酸麻黄碱的平均加样回收率为97.80%，RSD为0.95%（n=9）。

2.2.3 黄芩苷含量测定

1)色谱条件［7］与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（47∶53，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：280 nm。理论板数按黄芩苷峰计不低于2 500。在此色谱条件下，阴性对照品溶液色谱中，在与供试品溶液色谱相应保留时间处无色谱峰出现，阴性对照无干扰。详见图3。

2)溶液制备

对照品溶液：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.254 mg的溶液，即得。

供试品溶液［8-9］：精密量取“盐酸麻黄碱”项下试验用样品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀释摇匀，定容至100 mL容量瓶中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按照处方工艺，制备不含黄芩的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备溶液，即得。

3)方法学考察

线性关系考察：精密吸取2)项下制备的对照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释，定容，摇匀，制成系列不同质量浓度的对照品溶液。吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按1)项下色谱条件测定。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得黄芩苷对照品溶液的回归方程Y=0.024X+0.388（r=0.999 5，n=5）。结果黄芩苷进样量在0.254～2.540μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取黄芩苷对照品溶液10μL，按1）项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果黄芩苷峰面积的RSD为1.32%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取1号试验样品溶液，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，16，24 h时进样测定。结果黄芩苷峰面积的RSD为1.56%（n=7），表明供试品溶液在室温（25℃）条件下24 h内稳定。

重复性试验：取1号试验样品溶液，依法制备供试品溶液6份，按1）项下色谱条件进样10μL测定，记录色谱峰。结果黄芩苷峰面积含量的RSD为1.67%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取1号试验样品（黄芩苷含量为8.74 mg/mL）9份，各5 mL，按相当于样品中黄芩苷含量50%，100%，150%的比例加入黄芩苷对照品，平行制备3份，依法制成系列供试品溶液，按1）项下色谱条件进样10μL，测定峰面积，计算回收率。结果黄芩苷的平均加样回收率为92.60%，RSD为1.45%（n=9）。

2.2.4 干浸膏得率测定

取正交试验表中样品溶液，过滤，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h，置干燥器内冷却0.5 h，称定质量，计算干浸膏得率。

2.2.5 正交试验设计及结果［10-11］

根据儿咳灵糖浆制备工艺，将2.1.1项下苦杏仁沸水提取过滤后的药渣，按处方比例投入麻黄等13味药材中加水提取。以盐酸麻黄碱转移率、黄芩苷转移率和干浸膏得率为指标，采用L9（34）正交试验，对加水量、提取时间和提取次数进行考察。在前期预试验基础上，确定每个因素的3个水平，设计生成9次试验，每个试验重复3次。试验设计与结果见表5。可见，A因素对3种考察指标的影响最大。根据表6中各指标下最佳工艺水平组合，选择2个或2个以上的相同因素和水平作为优选工艺，得出最佳优选工艺为A3B1C2，即苦杏仁药渣与麻黄等13味药材加10倍量水，煎煮2次，每次1 h。

表5 L9（34）正交试验设计与结果Tab.5 Design and results of L9（34）orthogonal test

2.3 验证试验

称取10倍处方量药材，按2.1.1项下苦杏仁沸水入药提取最佳工艺条件重复制备3批，过滤，滤液备用；药渣和麻黄等其他13味药材按2.2.5项下最佳工艺条件重复制备3批，过滤，合并滤液。对苦杏仁苷、盐酸麻黄碱、黄芩苷的转移率及干浸膏得率6个指标进行考察。结果见表7。可见，通过正交试验得出的最佳工艺较稳定，可用于儿咳灵糖浆各药材的提取。

3 讨论

麻黄为方中主药，具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿作用，其主要有效成分为麻黄碱；苦杏仁有效成分为苦杏仁苷，具有镇咳平喘作用；黄芩主要有效成分为黄芩苷，具有清热解毒功效［12］。故采用麻黄碱、苦杏仁苷和黄芩苷3个有效成分作为考察指标对儿咳灵糖浆提取工艺进行优化。

表6 各因素对考察指标的影响分析结果（%）Tab.6 The influence of various factors on the inspection indicators（%）

表7 工艺验证试验结果Tab.7 Results of the verification tests

2017年，江苏省食品药品监督管理局认证审评中心发布《关于对平喘止咳糖浆等制剂品种质量标准提高相关事项的函》(药事便函〔2017〕117号)，公布儿咳灵糖浆的制备工艺为苦杏仁50 g，温水浸泡24 h，加热蒸馏，收集蒸馏液50 mL。文献［13-14］报道，温水条件下，苦杏仁酶会促进苦杏仁苷水解，降低苦杏仁苷含量。故在不改变原有水提工艺前提下，增加沸水入药提取和常规煎煮（即直接加水煎煮提取）。现行版要求苦杏仁是在温水浸泡加热蒸馏后，收集蒸馏液，检测苦杏仁苷的含量；另取药渣过滤后的滤液检测苦杏仁苷的含量。结果2种溶液都能检测出苦杏仁苷的含量，且含量一致，故正交试验设计时收集滤液，不再收集蒸馏液。以苦杏仁苷的含量为指标，比较3种水提方法进行工艺优化。预试验中分别考察了8，10，12倍加水量对苦杏仁提取效果的影响。结果表明，加水量增大到12倍，并不能提高苦杏仁苷的转移率。可能是苦杏仁属种子类药材，吸水率不高。为节约成本，正交设计中加水量因素设计为6，8，10倍量3个水平。考察了提取次数对苦杏仁苷转移率的影响，结果表明，增加提取次数，并不能提高苦杏仁苷的转移率，故正交设计中确定为提取2次。