星点设计响应面法优选牛樟叶水提物提取工艺*

张 蓓，余潇苓，万永艳，覃开羽，张洪平，梁学政△

（1.广西壮族自治区柳州市中医医院，广西 柳州545026；2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州310000）

牛樟树为樟科植物，原产地为台湾，生长在海拔450～2 000 m的山林间，因生长在百年以上的树干腐朽之心材内壁的真菌——牛樟芝而得名，被誉为森林中的红宝石［1］。牛樟芝可抗肿瘤、抗衰老、保护肝脏、增强免疫力等，但生长周期过长，品种珍稀，不利于产业化发展［2-6］。前期试验结果表明，牛樟叶水提物含有大量多糖类成分，开展水提物最优提取条件研究有一定的研究价值［7-10］。本研究中以多糖为指标性成分，采用星点响应面法优选提取方法，以最大程度提取出多糖类成分，为后期进一步优化提取方法及多糖的纯化试验奠定基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CAP型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精度为0.1 mg）；HWS-24型电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；UV1780-5型紫外分光光度计（岛津企业管理＜中国＞有限公司）；L600型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为240 W，频率为40 kHz）

1.2 试药

牛樟叶由广西柳州市天姿园艺有限公司提供，经柳州市中医医院吴冰副主任药师鉴定为樟科植物牛樟的叶子；苯酚（批号为10015318），硫酸（批号为10008316），乙醇（批号为10009164），均购自国药集团化学试剂有限公司；无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110833-201707，规格为100 mg，纯度为≥99%）。

2 方法与结果

2.1 多糖含量测定（硫酸-苯酚法）

溶液制备：取牛樟叶5 g，打粉，过60目筛，加250 mL蒸馏水，80℃水浴提取60 min，即得供试品溶液。取无水葡萄糖对照品0.024 8 g，精密称定，加水定容至250 mL容量瓶中，即得对照品溶液。

显色：精密量取多糖溶液1.0 mL，置10 mL具塞比色管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，混匀，精密加入浓硫酸3.0 mL，充分混匀，90℃水浴30 min。另以蒸馏水为空白对照同上操作，于490 nm波长处测定吸光度。

线性关系考察：取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置10 mL具塞比色管中，加水至1.0 mL，得系列质量浓度为0.01984，0.03968，0.05952，0.07936，0.099 2 mg/mL的葡萄糖对照品溶液，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速精密加入硫酸3 mL，摇匀，90℃水浴保温30 min，取出，迅速冷却至室温，同法制备空白溶液。照2015年版《中国药典（四部）》紫外-可见分光光度法（通则0401），在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标、葡萄糖质量浓度（X，mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，葡萄糖标准溶液的线性回归方程为Y=5.962 7X+0.033 7，R=0.999 6(n=5）。结果表明，葡萄糖标准溶液质量浓度在0.019 84～0.099 2 mg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。

精密度试验：精密量取对照品溶液（质量浓度为0.255 mg/mL）1.0 mL，连续进样测定5次。结果平均吸光度值为0.313 4，RSD为1.17%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取供试品溶液1.0 mL，分别于0，2，4，6，8，12，24 h时测定吸光度，并计算RSD值。结果平均吸光度值为0.321 4，RSD为1.67%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：平行制备同一批（批号为20190322）牛樟叶多糖提取液6份，依法显色后测定吸光度，并计算RSD值。结果样品中葡萄糖标准溶液吸光度的RSD为0.59%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品0.5 g，精密称定，共6份，加入20 mg葡萄糖对照品，按最优提取工艺提取样品，并将上述多糖置25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配置多糖溶液，显色后测定吸光度，并计算回收率和RSD值。结果见表1。

表1 多糖加样回收试验（n=6）Tab.1 Recovery test of polysaccharide（n=6）

2.2 单因素试验

打粉粒径：取牛樟叶1.0 g，精密称定，共3份，打粉，分别过20，24，40，60目筛，浸渍1 h，水浴温度为80℃，料液比为1∶50（m/V），考察牛樟叶可提取多糖含量。结果牛樟叶可提取多糖含量分别为9.51，10.29，11.67，15.40 mg/g。可见，打粉粒径越小，多糖含量越高。

浸渍时间［11］：取牛樟叶1.0 g，精密称定，共3份，打粉，过60目筛，水浴温度为80℃，料液比为1∶50（m/V），分别浸渍30，60，90 min，考察牛樟叶可提取多糖含量。结果牛樟叶可提取多糖含量分别为7.63，10.29，11.15 mg/g。可见，浸渍时间越长，多糖含量越高。

水浴温度：取牛樟叶1.0 g，精密称定，共3份，打粉，过60目筛，浸渍1 h，料液比为1∶50（m/V），分别置70，80，90℃恒温水浴锅中，考察牛樟叶可提取多糖含量。结果牛樟叶可提取多糖含量分别为9.27，10.29，13.10 mg/g。可见，随着水浴温度的升高，多糖含量升高。

料液比：取牛樟叶1.0 g，精密称定，打粉，过60目筛，浸渍90 min，水浴温度为90℃，分别加40倍、50倍、60倍水，即料液比为1∶40（m/V）、1∶50（m/V）、1∶60（m/V），考察牛樟叶可提取多糖含量。结果牛樟叶可提取多糖含量分别为13.62，10.29，8.94 mg/g。可见，随着料液比比例的增大，多糖含量降低。

2.3 提取工艺优化

提取工艺条件：根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取浸渍时间(因素A)、料液比(因素B)、水浴温度(因素C)为响应面模型的 自 变 量，采 用Design-Expert.v8.0.6软 件，设 置响应值目标［浸渍时间为30～90 min，料液比为1∶40（m/V）、1∶50（m/V）、1∶60（m/V），水浴温度最大为100℃］，确定最佳提取工艺。变量因素和水平见表2。根据响应面试验，得到的试验组合与结果见表3，方差分析结果见表4。结果显示，通过Design-Expert v8.0.6软件拟合得到的模型，其水平小于0.05，表明该模型有高度显著性；失拟项检验结果表明，失拟误差不显著（P=0.584 3），表明未知因素对试验结果影响很小，预测回归模型与试验结果拟合很好；预测模型的R2=0.996 1，表明多糖含量的试验值与预测值间的一致性较好；该模型的变异系数(CV)=4.13%＜5%，校正系数(R2Adj)=0.991 1，表明预测模型能反映99.11%响应值的变化，故通过回归方程能预测并分析试验的真实数据。由表4可见，各单因素对牛樟叶多糖含量(Y)影响从大到小依次为B＞C＞A，料液比与提取温度间的交互影响最显著。根据Design-Expert v8.0.6软件拟合得回归方程Y=10.33+1.98A-4.39B+4.28C+0.29AB+0.47AC-2.08BC-2.07A2+2.86B2+2.43C2。

表2 变量因素和水平Tab.2 Variable factors and their levels

表3 Box-Behnken试验设计与结果Tab.3 Design and results of Box-Behnken experiment

表4 方差分析结果Tab.4 Results of ANOVA

响应面图分析：通过Box-Behnken试验得到的多元回归模型所作的响应面图及等高线见图1。响应面的曲面越陡峭，表明该因素对响应值的影响越显著；等高线越密集则影响越显著，越稀疏则影响越小。可见，液料比所对应的曲面最陡峭，提取时间所对应的曲面最平滑，表明液料比对牛樟叶提取多糖含量的影响最显著，浸渍时间的影响最小。结果料液比为1∶40（即40倍蒸馏水）、温度为90℃、浸渍时间为75.61 min时，牛樟叶水提物中多糖提取率最高（26.924 7 mg/g）。

图1 各影响因素间的交互作用对多糖提取率的响应面图及等高线图A.The interaction between soaking time and liquid-material ratio B.The interaction between soaking time and extraction temperature C.The interaction between liquid-material ratio and extraction temperatureFig.1 The response surface diagram and contour diagram of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharide

验证试验：取牛樟叶5 g，精密称定，共3份，按最优提取工艺进行验证试验，操作方法同前。结果牛樟叶水提物中多糖含量为26.88 mg/g，与理论预测值26.92 mg/g基本吻合。

3 讨论

植物多糖生物活性广泛，独特活性和来源的天然性在保障人体健康应用中具有很大潜力［12-16］。但多糖结构复杂，种类繁多，其结构测定和分离纯化有一定难度；且在天然植物中含量低，不易分离，这给多糖的研究和应用带来了许多挑战。Box-Behnken星点设计响应面法相较于正交试验设计法和均匀设计法，具有预测性好、精确度高的特点，故本研究中采用单因素试验与Box-Behnken星点设计响应面法对牛樟叶水提物进行提取工艺优化。验证试验结果发现，实测值与预测值的相对误差较小，表明采用响应面法所得优化条件稳定、可靠。当提取工艺参数为药材过60目筛、料液比为1∶40（m/V）、水浴温度为90℃、浸渍时间为75.61 min时，牛樟叶水提物中可提取的多糖含量最高。