UPLC法同时测定蒲地蓝消炎口服液中9种成分的含量

阮仁余，邓祥敏，王 朝，朱星宇，陈广云

(1.江苏食品药品职业技术学院，淮安 223003；2.江苏护理职业学院，淮安 223005；3.淮安市食品药品检验所，淮安 223300)

蒲地蓝消炎口服液由蒲公英、苦地丁、板蓝根和黄芩4种中药制成，具有清热解毒、消肿利咽的功效，主治疖肿、腮腺炎、咽炎和扁桃体等疾病[1-2]，在儿科临床应用广泛，现代研究发现其具有抗炎、抗菌、抗病毒和免疫调节等药理作用[3-5]，方中蒲公英味苦、甘，性寒，清热解毒，消肿散结，利尿通淋；苦地丁味苦，性寒，清热解毒，散结消肿；板蓝根味苦，性寒，清热解毒，凉血利咽；黄芩味苦，性寒，清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎[1]。4药均苦寒，共奏清热解毒之效，对热毒引起的咽喉肿痛、疮痈肿痛具有显著疗效。

《中国药典》2015年版一部在蒲地蓝消炎口服液含量测定项下收载了黄芩苷和菊苣糖的含量测定，并未对苦地丁及板蓝根所含成分进行含量测定，记载的方法存在耗时长、效率低等缺点，因此有必要探索更加快捷、高效的多指标含量测定方法[1]。由于蒲地蓝消炎口服液临床应用极为广泛且疗效确切，近年来越来越多的学者关注到其多指标质量控制的重要性。董自波等[6]建立了能同时测定蒲地蓝消炎口服液中黄芩苷、汉黄芩素、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、紫堇灵和腺苷含量的HPLC法，为其多指标含量测定提供了参考，但该方法存在耗时长的缺点。吴婷等[7]利用UPLC-MS-MS法测定了蒲地蓝消炎口服液中菊苣酸、黄芩苷、绿原酸、汉黄芩素、黄芩素和咖啡酸的含量，该方法具有快速、高效的优点。高文雅等[8]利用高效液相色谱串联三重四级杆质谱法同时测定蒲地蓝消炎口服液中12种成分含量的方法，实现了对核苷类、黄酮类和有机酸类成分的同时测定，具有灵敏度高、分离度好、选择性强的优点，为其质量控制的提升提供了实验依据，但液质联用法存在仪器成本高、不易推广的缺点。UPLC法可用于中药复方复杂体系的含量测定，可以对多成分、多指标进行同时测定，符合中药复方整体质量控制的特点，且具有成本低廉、操作简便、快捷的优点[9-12]。

本文在文献已有方法的基础上，建立了能同时测定蒲地蓝消炎口服液中9种成分含量的UPLC法，该方法快速、准确、稳定，可为蒲地蓝消炎口服液的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters Acquity超高效液相色谱系统(美国Waters公司)，包括二元高压梯度泵、真空在线脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器和Empower 3色谱工作站；超声波清洗器(天津市泰斯特仪器有限公司)；BT25S型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；明澈TM-D 24UV纯水/超纯水系统(济南博美欧科技有限公司)，包括Progard预处理柱和Q-Gard超纯水柱。

1.2试药 对照品：绿原酸(批号110753-201715)、咖啡酸(批号110885-201702)、菊苣酸(批号111752-201601)、紫堇灵(批号111734-201802)、黄芩苷(批号110715-201718)、木犀草素(批号111520-201504)、汉黄芩苷(批号111728-201607)、黄芩素(批号111728-201607)和汉黄芩素(批号111514-201706)，均购自中国食品药品检定研究院；蒲地蓝消炎口服液(批号分别为1808121、1808124、1808127)，济川药业集团有限公司；三氟乙酸(色谱纯)，其余试剂均为分析纯，均购自南京化学试剂股份有限公司;水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Waters BEH C18色谱柱(30 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流动相：1 mL·L-1三氟乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脱：0～1 min，95%A～85%A；1～2 min，85%A～81%A；2～6 min，81%A～78%A；6～9 min，78%A～65%A；9～12 min，65%A～52%A；12～14 min，52%A～48%A；14～18 min，48%A～5%A。流速：0.3 mL·min-1；进样量：3 μL；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm[13-20]。色谱图见图1。

2.2对照品溶液的制备 精密称取9种成分对照品适量，加甲醇配制成单一对照品储备液。精密移取上述单一对照品储备液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得到9种成分质量浓度分别为0.342、0.164、0.691、0.250、4.424、0.572、1.114、0.120、0.323 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备 精密吸取蒲地蓝消炎口服液1 mL，置于量瓶中，加入甲醇1 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4阴性样品溶液的制备 根据蒲地蓝消炎口服液的处方，分别制备缺蒲公英、苦地丁和黄芩的阴性样品，按照2.3项下方法制成阴性样品溶液。

2.5线性关系考察 将2.2项下制备的混合对照品溶液分别稀释0、2、4、8、16倍，将稀释液注入液相色谱仪，按照2.1项下色谱条件进样测定，以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 9种成分的标准曲线Tab.1 Calibration curves of the 9 components

2.6精密度实验 精密吸取2.3项下制备的供试品溶液，重复进样6次，计算得9种成分峰面积的RSD值均小于1.46%，表明该仪器精密度良好。见表2。

2.7稳定性实验 按照2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 精密吸取10 μL，按照2.1项下色谱条件进样测定，计算9种成分峰面积的RSD值均小于1.90%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。见表2。

2.8重复性实验 按照2.3项下方法重复制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定9种成分的含量，计算得RSD值均小于2.59%，表明该方法重复性良好。见表2。

表2 9种成分的精密度、稳定性、重复性实验的RSD值Tab.2 RSD values of precision，stability and reproducibility tests of the 9 compounds

2.9回收率实验 精密量取已知含量的蒲地蓝消炎口服液(批号1808121)，每份0.5 mL，共6份。分别精密加入2.2项下制备的绿原酸、咖啡酸、紫堇灵、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素单一对照品储备液各25 μL及菊苣酸单一对照品储备液50 μL、黄芩苷单一对照品储备液70 μL。按照2.3项下方法制备溶液，补充甲醇使总体积为2 mL，按照2.1项下色谱条件进样测定，计算9种成分的平均回收率。结果见表3。

表3 9种成分的回收率 (n=6)Tab.3 Recovery rates of the 9 compounds (n=6)

2.10样品的含量测定 取蒲地蓝消炎口服液适量，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，测定9种成分的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果Tab.4 Results of sample content determination

3 讨论

本实验通过DAD检测器对供试品溶液进行全波长扫描，结果发现，供试品溶液在280 nm波长处各成分峰形良好，且分离度较高。此外，实验初期对流动相进行了考察，分别考察了水-甲醇、水-乙腈、甲酸-乙腈、磷酸-乙腈、三氟乙酸-甲醇和三氟乙酸-乙腈系统。结果发现，样品在1 mL·L-1三氟乙酸-甲醇系统下，响应最好，峰形最佳，最终通过多个洗脱梯度的考察，优选了本文的洗脱条件，可以达到峰形好、分离度高的效果。

《中国药典》2015年版中对蒲地蓝消炎口服液的质量控制含量测定指标为菊苣酸和黄芩苷，其所用方法为HPLC法，存在耗时长、不能同时测定的缺点。本实验利用UPLC法，在含量测定的基础上增加了绿原酸、咖啡酸、紫堇灵、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素7种成分的含量测定，具有简便、快捷的优势，能够更加全面地评价蒲地蓝消炎口服液的质量，符合中药制剂整体评价的要求。

本实验采用UPLC法在17 min内同时测定了蒲地蓝消炎口服液中9种成分的含量，该方法快速、准确、重复性高、可操作性强，为蒲地蓝消炎口服液的质量标准研究提供了参考。