九华黄精炮制前后多糖类成分结构变化研究

徐如静，梁 娟，俞年军，3，吴鸿飞，吴振东，周 安

(1.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；3.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012；4.安徽省青阳县九华中药材科技有限公司，安徽 池州 242800)

九华黄精也称地藏黄精，主产于安徽省九华山周边区域，为百合科黄精属多花黄精，十大皖药之一，属于药食两用类中药，具有补中益气、滋阴润肺等功效。多糖是黄精的主要活性成分，具有抗疲劳、调节免疫、降血糖、抗菌和延缓衰老等作用。相对于其他产地的多花黄精，九华黄精具有口感肉质、多糖含量高、抗氧化活性强等特点。

生九华黄精因对咽喉具有刺激性和微小的毒性，通常需经炮制后使用，其炮制方法常用的有酒蒸和九蒸九晒法两种，临床用黄精饮片多为酒蒸品，主要用于配伍治疗糖尿病、心血管等疾病。《本草纲目》记载了九蒸九晒的炮制方法，目前市场上畅销的黄精类功能食品多以该方法制备，通常认为九蒸九晒炮制工艺一方面可以改变黄精的口感，纠偏药性及减少毒性成分，还能改善其感官品质，增强黄精强身健体、延缓衰老等功效。多糖为九华黄精主要药效成分，不同分子段的黄精多糖在抗氧化、抗菌、增强免疫等方面均具有一定活性。2020年版《中华人民共和国药典》规定多糖为黄精质量控制成分，且规定多糖的含量不得少于7%。目前国内市场九华黄精饮片均为酒蒸品，功能食品为九蒸九晒方法制备，然而两种制备方法对九华黄精多糖含量及结构的影响缺乏研究。多糖的生物活性与多糖分子量、单糖组成以及结构差异密切相关。笔者以九华黄精为研究对象，考察酒制及九蒸九晒炮制前后多糖含量、分子量排布、单糖组成等结构信息进行差异性分析，研究结果可为九华黄精及其炮制品的质量控制和功效差异研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器 ALPHA1-2LD真空冷冻干燥机：德国CHRIST公司；Agilent 1100高效液相色谱仪(配备高压二元泵，柱温箱)：美国安捷伦公司；TSK gel G3000PWXL色谱柱(7.8 mm×300 mm，7 μm)：日本东曹株式会社；Shimadzu GC-2010plus系统、UV-2550紫外分光光度计：日本岛津公司；Nicolet 5700红外光谱仪：美国赛默飞公司。

1.2 药材与试剂 九华黄精生药材采自安徽省池州市青阳县酉华镇，经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定为百合科黄精属植物多花黄精

Polygonatum

cyrtonema

Hua.的干燥根茎。无水葡萄糖(纯度98%，批号 110833-200904)、甘露糖(纯度98%，批号 xvwv-501H)：中国药品生物制品检定所；半乳糖(纯度98%，批号 GS04178209)：BIO BASIC INC公司；葡聚糖系列对照品(平均分子量为3，6，10，20，40，70，100，200 kDa)：Pharmacia Biotech公司；苯酚(批号 C1523045)：阿拉丁公司；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 黄精炮制品的制备

2.1.1 生黄精的制备 新鲜九华黄精根茎用水清洗，去除须根和表面的泥沙，洗净，切厚片，置60 ℃烘箱中干燥，粉碎后备用。

2.1.2 酒黄精的制备 按照文献[13]的方法，取干燥后的生黄精200 g，加入20%黄酒拌匀。浸润5 h后，隔水蒸至黄酒被吸净，表面色泽黑润时取出，晾晒，切厚片，干燥，得140 g酒制黄精。

2.1.3 九蒸九晒黄精的制备 取干燥后的生黄精200 g，用清水蒸制7 h，取出放入干燥箱(65 ℃)中烘干6 h，此步骤重复9次，得九蒸九晒黄精130 g。

2.2 黄精多糖的提取 按照文献[14]的方法，分别取经干燥处理的生黄精、酒黄精、九蒸九晒黄精，用中药粉碎机粉碎，过60目筛，得黄精粉。取一定量的3种黄精粉，分别按料液比1∶10加入蒸馏水，进行加热回流提取，提取次数为2次(每次2 h)，合并滤液，旋转蒸发仪进行减压浓缩至一定容积。向浓缩液中加入无水乙醇至乙醇含量大于80%，沉淀多糖(4 ℃)，离心(3 500 r/min，15 min)，弃上清，得到沉淀即为黄精粗多糖。将粗多糖溶于蒸馏水中，用Sevage试剂脱蛋白，活性炭脱色，透析(透析袋分子量为3 500 Da)48 h，真空冷冻干燥，得黄精多糖冻干粉。

2.3 黄精多糖的含量测定

2.3.1 葡萄糖标准溶液的制备 精密称取无水葡萄糖10 mg，加双蒸水溶解并用100 mL容量瓶定容，得0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液。

2.3.2 标准曲线的绘制 精密移取上述葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL分别置于10 mL试管中，各管用双蒸水补充至1 mL，随后依次分别加入5%苯酚溶液1 mL和浓硫酸5 mL，摇匀，于80 ℃水浴反应35 min。室温放置冷却，以葡萄糖标准溶液含量为零的试管作为空白对照，于490 nm处测定吸光度。

2.3.3 样品的测定 精密称取3种多糖冻干粉各10 mg，用纯水溶解成0.1 mg/mL的多糖溶液，取各溶液0.3 mL，分别置于3支不同的10 mL试管中。按照“2.3.2”项下标准品溶液的测定方法，测定各样品溶液的吸光度，计算多糖含量。计算公式为多糖含量(%)=苯酚硫酸法测定的多糖质量/黄精药材的质量×100%。

2.4 分子量排布测定

2.4.1 色谱条件 TSK gel G3000PWXL凝胶色谱柱(7.8 mm×300 mm，7 μm)；DEAC901030示差折光检测器(RID)；流动相为超纯水；样品进样容积为10 μL；流速为0.5 mL/min；柱温保持35 ℃。

2.4.2 标准曲线的绘制 精密称取不同分子量的葡聚糖(分子量分别为3、6、10、20、40、70、100、200 kDa)，分别用双蒸水配制成1 mg/mL葡聚糖溶液，经0.22 μm微孔滤头净化，按分子量由小到大依次进行高效凝胶渗透色谱(high-performance gel-permeation chromatography，HPGPC)分析，以葡聚糖的保留时间为横坐标，相应的相对分子量的对数为纵坐标，绘制得标准曲线。

2.4.3 样品的制备 精密称取纯化后的生黄精、酒黄精、九蒸九晒黄精多糖10 mg，加超纯水溶解，配成1 mg/mL溶液，过0.22 μm微孔滤头，备用。

2.5 单糖组成分析

2.5.1 气相色谱法(gas chromatography，GC)分析条件 采用RTX-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：高纯氮气；分流比20∶1；氢火焰离子化检测器；程序升温：柱温先于120 ℃保持2 min，之后以3 ℃/min速度升至210 ℃，并保持40 min。

2.5.2 多糖的水解 分别精密称取生黄精、酒黄精、九蒸九晒黄精多糖冻干粉各10 mg置于3支不同的试管中，加入2.0 mol/L三氟乙酸溶液3 mL，密封后置于120 ℃充分水解4 h。将得到的3种多糖水解液分别真空旋转蒸发至干，加入甲醇3 mL，再次蒸干，如此重复3次，以除去残留的三氟乙酸，得各多糖样品水解液，最后将多糖样品置于干燥箱中，备用。

2.5.3 多糖水解液及单糖标准品衍生化 精密称取各单糖标准品(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖)及3种水解多糖样品各10 mg于试管中，各管分别加入10 mg盐酸羟胺和1 mL无水吡啶，混匀，于90 ℃水浴加热30 min，取出放冷至室温，加入无水乙酸酐1 mL，继续于90 ℃水浴加热30 min进行乙酰化，反应完成后，置于室温冷却，过0.22 μm有机滤膜，得待测样品，用于GC分析。

2.6 红外光谱分析 分别取九华黄精及炮制品多糖各1 mg，加澳化钾研磨压制成1 mm厚度，测定其在4 000～400 cm范围内的红外光谱。

3 结果

3.1 黄精多糖的色泽和含量 生黄精及炮制后的黄精经水提醇沉和透析处理后得到的黄精多糖在色泽上存在显著差异(见图1)，生黄精多糖为白色粉末，而经炮制后的酒黄精和九蒸九晒黄精为棕色粉末。炮制前后的黄精多糖含量也存在显著差异，生黄精的多糖含量为44.53%±1.21%，酒黄精的多糖含量为23.59%±0.56%，九蒸九晒黄精的多糖含量为18.02%±0.86%，生黄精经酒制和九蒸九晒后，多糖含量分别降低了20.94%和26.51%。

图1 黄精多糖炮制前后外观变化

3.2 分子量排布测定 九华黄精及炮制品多糖的相对分子量见图2，生黄精多糖只有一个分子量片段(峰2)，相对分子量为5.34 kDa。酒制和九蒸九晒黄精多糖则出现多个色谱峰，其中九蒸九晒黄精的分子量主要集中在两个片段(峰1和峰2)，相对分子量分别为75.8 kDa、5.53 kDa。酒黄精的分子量主要集中在1个分子量片段(峰1)，相对分子量为76.4 kDa。

注：1、2.多糖色谱峰；3.溶剂峰；A.生黄精；B.九蒸九晒黄精；C.酒黄精；D.溶剂图2 生黄精、酒黄精和九蒸九晒黄精多糖分子量排布色谱图

3.3 单糖组成分析 标准单糖和炮制前后多糖样品的GC色谱图及单糖百分含量见图3和表1。结果表明3种多糖均含有一定量的半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸。酒蒸和九蒸九晒黄精多糖中甘露糖含量有所增加。与其他两种多糖相比，酒黄精中含有少量阿拉伯糖，且半乳糖醛酸的相对含量由19.48%降低到8.38%，鼠李糖含量增加了5.31%。

注：A.单糖标准品；B.九蒸九晒黄精；C.酒黄精；D.生黄精；Rha为鼠李糖；Ara为阿拉伯糖；Glc为葡萄糖；Gal为半乳糖；Man为甘露糖；GalA为半乳糖醛酸图3 标准单糖及多糖样品衍生物的GC图谱

表1 黄精多糖的单糖组成

图4 生黄精(A)、酒黄精(B)和九蒸九晒黄精(C)的红外光谱图

表2 黄精多糖红外光谱图解析

4 讨论

在本研究中，九华黄精多糖的含量高达44.53%。张静等通过比较不同产地黄精多糖含量，结果发现安徽九华黄精多糖含量明显高于其他产地黄精。九华黄精经酒制和九蒸九晒炮制后，其多糖含量显著降低，可能是由于在高温蒸制过程中，部分多糖或黏液质水解成单糖或低聚糖所致，这从经反复蒸制的九蒸九晒黄精多糖含量低于经一次蒸制的酒黄精也有所体现。采用HPGPC法对多糖分子量的测定结果表明，炮制之后多糖分子量增加。Sun等在考察滇黄精酒制前后分子量变化时，也发现多糖分子量增加的现象，并认为多糖分子量增加可能与美拉德反应有关。Liu等在何首乌蒸制过程中发现一种新的大分子化合物，并通过检测美拉德反应中间产物5-羟甲基糠醛和2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮的动态变化，证实了这种物质是糖类和氨基进行美拉德反应的产物。黄精中除了含有多糖、皂苷等主要成分，还含有糖蛋白(如凝集素)。因此，笔者认为可能是黄精多糖中还原糖如葡萄糖、半乳糖等的醛基和蛋白质中的氨基在加热条件下发生美拉德反应，形成含氮的棕色大分子聚合物或共聚物，从而导致多糖分子量增加。美拉德反应能赋予食品独特的风味和色泽，更适宜作为功能食品使用。在单糖组成上，与其他黄精相比，九华黄精含有一定量的甘露糖，炮制后单糖组成的变化则可能和炮制过程中多糖类成分的糖基脱落，或者皂苷类成分水解脱糖基有关；由于阿拉伯糖主要存在于植物细胞壁中，也有可能是受酒制工艺的影响，酒黄精细胞壁破坏程度更大，在多糖提取过程中细胞壁里的多糖被更多提取出来，表现出阿拉伯糖相对含量增加。但具体原因有待进一步研究。红外光谱分析结果显示，3种黄精均含多糖的特征吸收峰。红外光谱分析结果还表明与生黄精多糖相比，酒黄精和九蒸九晒黄精中多糖均发生了不同程度的酯化，原因可能是高温条件使部分羧基酯化。酒黄精的酯化度高于九蒸九晒黄精，这可能是由于醇羟基的存在更有利于酯化造成的。黄精多糖为黄精发挥功效的主要有效成分，多糖的性质和生物学功能与其分子量和单糖组成等结构密切相关，九华黄精炮制前后其多糖组成和结构的变化会影响性质和功能。研究这些变化，对研究九华黄精炮制工艺、质量控制和作用机制具有重要意义。