红外光谱结合化学计量学快速鉴别不同环境发汗丹参

刘 洁，单晓晓，李国转，彭代银，王 雷，4，俞年军，王国凯，陈卫东，4

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院，安徽 合肥 230012；3.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；4.中药饮片制造新技术与研发安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

丹参为唇形科植物丹参

Salvia

miltiorrhiza

Bge.的干燥根和根茎，主要活性成分包括脂溶性丹参酮类及水溶性丹酚酸类。丹参入药，首见于东汉《神农本草经》，属于常用大宗中药材。丹参在临床上广泛用于治疗心脑血管系统疾病，还具有抗肿瘤、抗炎、保肝等作用。发汗是丹参的传统产地初加工方法，通过发汗可以使丹参中化学成分发生变化。不同环境下发汗对丹参有效成分有影响，通常采用色谱、质谱法进行分析，但分析方法步骤复杂、检测效率低，且仅反映相关分子的特性；而红外光谱具有高度的专属性和特征性，是鉴别物质和分析物质化学结构的有效手段，可以反映药材聚集态的宏观特性，并在样品峰和峰强度方面提供独特的“指纹”，可以快速有效地对药材质量进行整体控制。主成分分析(principal component analysis，PCA)为选用较少的几个综合指标，能反映原来众多具相关性的指标信息，降低原始数据的维度，适用于中药多种化学指标的分析。PCA结合马氏距离(Mahalanobis distance，MD)计算降维后的新变量，既保证光谱完整性，又不受变量间相关性和单位的影响。

本实验采取傅里叶红外光谱技术结合化学计量学方法建立PCA-MD判别分析模型，拟比较不同环境下发汗丹参中醇提物和水提物，通过观察比较各谱图的吸收峰特征，为丹参发汗环境筛选提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 Nicolet6700型傅里叶红外光谱仪(氘代三甘氨酸硫酸酯检测器)：美国Thermo公司；BJ-150型高速多功能粉碎机：德清拜杰电器有限公司；RE-5205型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试剂 丹酚酸B(纯度≥98%，DST190918-009)、丹参素(纯度≥98%，DST191201-015)、丹参酮ⅡA(纯度≥98%，DST190117-011)标准品：成都乐美天医药科技有限公司；溴化钾碎晶：上海迈坤化工有限公司；乙醇(190401)：上海苏懿化学试剂有限公司；实验所用试剂均为分析纯。丹参原药材由安徽春之蔚农业科技有限公司提供，为种苗栽培的1年生丹参鲜品。原植物经安徽中医药大学彭华胜教授鉴定，丹参是唇形科鼠尾草属

Salvia

miltiorrhiza

Bge.正品。

2 方法

2.1 供试品的制备

2.1.1 药材的预处理 ①发汗丹参的制备：从鲜品丹参中挑选出粗细均匀的根条，去泥，去除芦头。将其随机分成3组(每组约300 kg)，分别置于空旷阴凉、空旷光照、室内环境下堆积，模拟丹参传统产地加工“发汗”方法(即堆积7 d以使内部水分溢出。在药材堆中保留松散的间隙用于通风，周边略微覆盖，并且定期打开覆盖物以进行通风。为了使整个药材堆均匀排汗，将药材堆展开一夜，然后每2 d堆放1次，每次堆放2 d并摊开一夜，重复以上操作3次。当根的内核变成紫红色时，将药材堆展开并放在干净、干燥、阴凉的地方晾干)发汗，编号分别为发汗1号堆、发汗2号堆和发汗3号堆，制成发汗丹参样品。②非发汗丹参制备：将新鲜丹参根置于背阴、干燥、洁净、通风的地方晾干(过程中避免积压，防止产热)。

2.1.2 丹参水提物的制备 取丹参发汗及非发汗品适量，切成小段，加12倍量水浸泡1.5 h，于80 ℃提取2次，每次提取时间为1.5 h，合并提取液，滤过，滤液60 ℃减压浓缩成清膏。放冷，加乙醇使含醇量为70%，静置12 h，取上清液，减压回收乙醇，并浓缩至稠膏，干燥，粉碎成细粉，过0.18 mm筛，即得丹参水提物。

2.1.3 丹参醇提物的制备 取丹参发汗及非发汗品适量，切成小段，加8倍量95%乙醇加热回流提取3次，每次0.5 h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩成稠膏，用热水洗至洗液无色，80 ℃下干燥，粉碎成细粉，过0.18 mm筛，即得丹参醇提物。

2.2 红外光谱的测定 分别取发汗、非发汗水提及醇提粉末与溴化钾以1∶50比例混合，置玛瑙研钵中研磨成极细粉，转移至红外光谱测定专用模具中，用10 t以下的压力压成均匀透明的薄片；光谱范围为4 000～525 cm，每张光谱累加扫描16次，光谱分辨率为4 cm，扫描过程中实时排除二氧化碳和水蒸气干扰。

2.3 光谱数据处理 利用傅里叶变换红外光谱仪得到相应的红外光谱图；用OMNIC 9.0软件进行自动基线校正和纵坐标归一化处理，采用Origin 8.0软件绘制红外光谱图，用The Unscrambler 11软件对光谱图进行优化处理后建立PCA-MD判别模型。

3 结果

3.1 方法学实验

3.1.1 精密度考察 将丹参醇提物与溴化钾按比例混合后压片，重复测定其红外图谱6次，6张红外图谱共有峰波数的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)小于4.08%。

3.1.2 稳定性考察 分别在0、1、2、4、8、24 h对同一压片红外光谱进行测定，6张红外图谱共有峰波数的RSD小于8.08%。

3.1.3 重复性考察 将丹参醇提物制成6个压片测定红外图谱，6张红外图谱共有峰波数的RSD小于4.84%。

3.3 不同环境下发汗丹参水提物的红外光谱图分析 从图3中可知：①3种不同环境下发汗丹参的平均红外光谱图的峰形基本相似；②不同环境发汗丹参水提物平均光谱峰强度在A区域(3 700～2 800 cm)和B区域(1 800～500 cm)存在明显差异，发汗后1 520、1 262 cm处吸收峰较非发汗品增强，推测酚酸类含量增加，且在发汗过程中1 041 cm处吸收峰强度降低，可能为多糖类成分降解，发汗3号堆(室内环境)强度明显高于其他发汗品，2号堆次之；③在B区域(指纹区)，少数吸收峰在位置和强度上有差异。

为了更直观地比较不同环境发汗丹参红外光图谱的差异，对1 800～800 cm区域进行二阶求导处理(见图4)。对一系列动态红外光谱进行数学分析，不仅提高红外光谱图的分辨率，而且提供基团之间相关性的详细结构信息，可用于鉴别和研究物质成分或基团之间的相互作用，增强图谱特征。如非发汗丹参在1 520.85、1 404.02 cm处和发汗品在1 521.53、1 405.86 cm的吸收峰对应甲基和亚甲基弯曲振动。但发汗丹参吸收峰强度略高于非发汗品，提示酚酸类含量增加；非发汗的1 261.59 cm处、发汗的1 260.92 cm峰对应丹参素钠在1 261 cm处的吸收峰，发汗吸收峰强度高于非发汗品，表明发汗后含酚酸类含量增加。同样，在1 200～600 cm范围内为糖类异构体特征吸收区，可以明显观察到发汗丹参碳水化合物的相对含量较非发汗丹参略有下降，提示在发汗过程中多糖类成分降解。

图1 丹参酮ⅡA(A)、丹参醇提物(B)、丹参素(C)、丹酚酸B(D)及丹参水提物(E)的一维红外光谱图

图2 丹参酮ⅡA(A)、丹参醇提物(B)、丹参素(C)、丹酚酸B(D)、丹参水提物(E)的二阶导数红外光谱图

3.5 丹参发汗与非发汗水提物、醇提物的红外光谱分析 图3中，发汗与非发汗丹参水提物与醇提物一维红外光谱相似，但在吸收强度和吸收带上有一定差异。如水提物特征吸收带是1 520 cm处，而醇提物在此无吸收；醇提物特征吸收带在1 670 cm处的吸收峰强于水提物，而水提物在此无吸收，由此可区分水提物和醇提物。不同环境发汗丹参绝大部分特征吸收峰一一对应，但部分特征吸收峰存在数目、位置和吸收强度的差异，表明丹参经不同环境下发汗后化学成分和含量发生了改变。

注：A.非发汗水提物；B.发汗1号堆水提物；C.发汗2号堆水提物；D.发汗3号堆水提物；E.非发汗醇提物；F.发汗1号堆醇提物；G.发汗2号堆醇提物；H.发汗3号堆醇提物图3 非发汗与不同环境下发汗丹参水提物与醇提物的一维红外光谱图

3.6 PCA-MD判别分析模型

3.6.1 光谱图优化处理 对8组样品(每组3批)的红外光谱图进行一阶求导、二阶求导、一阶求导加平滑、二阶求导加平滑处理后，发现最佳预处理方案为二阶求导加平滑，提取前5个主成分时变量特征的解释能力达到81.2%，且判别正确率为100%，故选此方法建立PCA-MD判别模型。见表1。

3.6.2 建立判别模型 不同环境下发汗丹参经预处理后，提取前5个主成分进行PCA-MD判别分析(见图5)，8组样品可以分开。发汗与非发汗丹参的醇提物距离较近，推测其经过发汗处理后化学成分变化相似，丹参经发汗后化学成分发生不同程度的改变，根据其差异可将丹参不同发汗品完全区分，且差异越大，空间距离越大。

4 讨论

红外光谱由分子的振动及转动能级的跃迁引起，主要用于定性鉴别和结构分析，且样品不需要进行前处理，使样品之间的微小差异能够最大限度地保留下来，不会被人为干扰、甚至破坏，因此，可以从整体上表征不同环境下发汗丹参的差异。不同环境下发汗丹参的原始图谱峰形变化极为相似，且共有峰较多，可显示出丹参特有的光谱特征，这与课题组前期用高效液相色谱指纹图谱鉴别结果一致，说明发汗处理后的丹参整体化学组分并没有发生改变。经二阶求导及结合化学计量法，表明丹参经不同环境下发汗后化学成分和含量发生了改变。发汗后水提物中酚酸类含量增加，与邓寒霜等研究的发汗后酚酸类含量均有增加相一致，且发汗3号堆(室内环境)强度明显高于其他发汗品，2号堆次之；醇提物酮类含量升高，与课题组前期研究及赵志刚等的研究结果相符，且发汗2号堆(空旷光照)强度明显高于其他炮制品，3号堆次之，与课题组前期研究结果一致；在发汗过程中可能发生糖苷的水解和糖类的代谢。红外光谱结合PCA-MD判别模型可准确区分发汗与非发汗丹参，丹参发汗后含量的变化可能与堆置发汗过程中生物组织内部的微生物和功能酶系促发资源性化学物质的生物转化与化学转化有关，具体发汗机制有待进一步研究。

注：A.非发汗水提物；B.发汗1号堆水提物；C.发汗2号堆水提物；D.发汗3号堆水提物；E.非发汗醇提物；F.发汗1号堆醇提物；G.发汗2号堆醇提物；H.发汗3号堆醇提物图4 非发汗与不同环境下发汗水提物与醇提物二阶导数红外光谱图

表1 光谱预处理对PCA-MD判别模型的影响

图5 PCA-MD得分图