多花黄精多糖PcUER1基因的克隆与表达分析

程 鹤，祝明珠，徐 君，刘峻麟，2，俞年军，2，彭代银，周 安，吴振东，韩荣春

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012；3.安徽省青阳县九华中药材科技有限公司，安徽 池州 242800)

黄精为2020年版《中华人民共和国药典》收载的常用中药材，其正名始见于《名医别录》，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效。其化学成分主要为多糖、甾体皂苷类，多花黄精多糖由多种单糖包括葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖等构成。黄精多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、调血脂、提高免疫功能和记忆力等作用。

鼠李糖是一种单糖，其在植物体中主要的功能是参与植物多糖合成，也常作为细菌荚膜和细胞壁的组成成分，鼠李糖在植物和细菌界中的应用很广泛。3,5-异构酶/4-还原酶(3,5-epimerase/4-reductase,UER1)是UDP-葡萄糖向UDP-鼠李糖转化的关键酶之一，这种酶有还原酶和异构酶的酶活结构域。庞朝友在棉花纤维素中发现该酶的基因，其为核苷糖并主要参与多糖的合成。拟蓝芥细胞壁中存在该酶的基因，并参与鼠李糖的合成。UER1参与多糖的合成，并且是多糖合成中必不可少的酶基因。因此，本研究对多花黄精多糖中UER1基因进行克隆，并进行生物信息学分析，为其多糖的生物合成提供理论参考，并为多花黄精中次生代谢产物的研究提供实验基础；同时，构建多花黄精PcUER1基因的质粒的体外载体，为后续的蛋白组学研究提供实验依据。

本课题组前期研究显示，UER1是多花黄精多糖中第6种单糖UDP-鼠李糖的关键酶基因，而UDP-鼠李糖是由UDP-葡萄糖脱水酶(RHM)及UER1催化合成。

1 材料

1.1 药材与试剂 多花黄精植株采自安徽省青阳县等地，后移植至安徽中医药大学种质资源圃，经俞年军教授鉴定为百合科黄精属植物多花黄精

Polygonatum

cyrtonema

Hua。取多花黄精新鲜植株，分别为根、根茎、茎、叶4个部位，用清水洗净表面泥土，先用75%乙醇无菌操作，并用无菌水洗净3次，吸干水分，立即在液氮中研磨，置于-18 ℃冰箱保存，以备提取总RNA。

琼脂糖凝胶DNA凝胶回收试剂盒(DP209-02)、pGM-TFast克隆试剂盒(VT151022)、FastQuant RT试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司。菌株与质粒：DH5α。

1.2 仪器 PCR扩增仪、Eppendorf 5810R型高速离心机：德国Eppendorf公司；ScanDrop200型核酸分析仪：德国Jena分析仪器股份有限公司；IMS-100全自动雪花制冰机：江苏省常熟雪科电器有限公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统：英国SYIGLHR/1528。

2 方法

2.1 总RNA提取及cDNA的合成 按照Liu等方法和Trizol试剂盒说明书提取RNA，先提取多花黄精4种部位的总RNA，再用ScanDrop检测RNA的纯度与浓度，使OD/OD和OD/OD均达到1.8以上，采用Aglient 2100检测总RNA的完整性。采用FastQuant RT试剂盒逆转录RNA，得到第一链cDNA。

2.2 引物设计及PcUER1的序列信息确认 对测序得到的PcUER1酶基因的序列信息进行确认。在NCBI中Blastx进行检索PcUER1序列，并保存同源物种中序列信息。使用在线程序Primer-BLAST设计多花黄精的特异性引物序列，进行后续的PCR反应。引物合成由上海生物工程股份有限公司提供。PcUER1基因克隆引物的正链为5′-CCGCGCAATTTCATCACCAA-3′，反链为5′-CCAGGGTTGGTGAAGTTCCA-3′；管家基因PcTubulin的正链为5′-TGGGATACGGCACGAGATTG-3′，反链为5′-CCGGAGATCCTTGGACATCG-3′。扩增产物为900 bp的DNA。

得到PcUER1第一链的PCR扩增产物后，通过1.0%琼脂糖凝胶板对其进行电泳检测，在紫外灯条件下把凝胶板上明亮条带产物切除，最后使用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒并按说明书操作方法回收并纯化DNA。取纯化cDNA，按照pGM-TFast克隆试剂盒操作步骤，让其和载体pGM-TFast连接，得到连接载体产物，整个过程需在冰上进行。将含有外源基因的质粒通过热休克转化入大肠杆菌DH5α后，37 ℃震荡培养过夜。使用Invitrogen质粒提取试剂盒回收质粒后，使用ScanDrop检测质粒的浓度和纯度，符合标准后，再使用T7-F/SP6通用引物PCR后，送至苏州金唯智生物科技公司进行双向测序。

2.3 生物信息学分析 使用NCBI中BLAST搜索比对PcUER1的同源序列，使用MEGAX软件构建该基因同源物种序列的系统进化树，使用软件ProtParam、在线软件SWISS-MODEL和在线软件SOMPA对PcUER1基因编码的蛋白序列进行理化性质分析、二维结构预测及三维结构的预测分析。

2.4 实时荧光定量PCR检测多花黄精不同组织的PcUER1表达水平 将保留的合格RNA样品(OD/OD>1.8,OD/OD>1.8)按照FastQuant试剂盒说明书操作步骤逆转录成cDNA第一条模板链。使用在线软件Primer设计实时荧光定量PCR所需的引物(见“2.2”项)，使用稳定性较好的微管蛋白基因(PcTubulin)作为内参。选择Fast Start Essential DNA Green Master作荧光染料，使用荧光定量PCR仪(ROCHE Z480型)进行扩增反应，每反应体系为15 μL，各反应均平行3次，以不含引物的反应体系作阴性对照，并以溶解曲线分析以确保扩增产物的特异性。

2.5 葡萄糖标准曲线建立 按照2020年版《中华人民共和国药典》规定，取无水葡萄糖对照品33 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置10 mL具塞刻度试管中，用蒽酮-硫酸法测定含量，绘制标准曲线。

2.6 多花黄精不同部位多糖含量检测 分别将3株青阳多花黄精分为3组，每组不同部位干燥粉末取0.25 g，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中加热回流1 h，趁热滤过，将残渣滤纸置烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流1 h，趁热滤过，合并滤液与洗液，放冷，转移至250 mL量瓶中，定容精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，按照标准曲线的制备项下方法，自“加水至2.0 mL”起，测定吸光度，每组平行3次。

3 结果

3.1 多花黄精多糖PcUER1基因的克隆 基于多花黄精转录组学数据。使用特异性引物PcUER1，20 μL体系扩增，进行cDNA的合成。电泳结果(见图1)显示，该基因在多花黄精茎中存在，并得到900 bp的单一明亮条带，与预期的条带大小一致。

注：M. DL2000；1、2均为PcUER1基因图1 PcUER1基因的克隆

通过BioEdit软件中GraphicsView功能将PcUER1基因的核酸序列转译成氨基酸序列。结果显示PcUER1基因片段有900 bp，编码299个氨基酸。PcUER1基因cDNA的核酸序列及推测的氨基酸序列见图2。多花黄精与百合科虎眼万年青和禾本科二棱大麦同源性较高，分别达92.03%、89.00%。

3.2 PcUER1蛋白三维结构预测 使用ProtParam软件对PcUER1蛋白的理化性质进行分析。通过分析蛋白分子式为CHNOS，其原子总数为4 714。由20种共299个氨基酸组成，分子量为33 510.25 Da，预测等电点值为5.74，预测该蛋白较稳定，其不稳定系数为22.12，预估此蛋白在体外哺乳动物的网织红细胞中半衰期为30 h，酵母体内达20 h以上，大肠杆菌体内有10 h以上的半衰期。脂肪族指数为87.66，亲水性总平均数为-0.257，提示该蛋白为疏水性蛋白。数据结果显示，序列的N-末端是甲硫氨酸(Met)，氨基酸的个数及组成情况见表1。

注：红色实心圆和绿色三角形表示辅因子结合基序和催化四分体基序图2 PcUER1基因cDNA的核酸序列及氨基酸序列

表1 PcUER1氨基酸的组成

使用在线软件SOMPA对PcUER1蛋白的二级结构进行预测。结果(见图3)表明，此蛋白具有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲，分别占41.14%、6.35%、13.38%和39.13%。综合分析结果显示,PcUER1蛋白的主要结构是α-螺旋，其次是无规则卷曲，β-转角结构最少。

以SWISS-MODEL在线软件为平台，得到的结果(见图4)表明，该蛋白序列识别度为86.22%，与BLAST比对的覆盖度可达95%，该蛋白与模板匹配的结果中有281个氨基酸配对成功，占总数的93.98%。

注：紫色示无规则卷曲，蓝色示α-螺旋，绿色示β-转角，红色示延伸链；横坐标为碱基数图3 PcUER1蛋白二维结构预测

图4 PcUER1蛋白的三维结构预测

由图4得出，与该蛋白二级结构预测结果相一致的是，PcUER1编码的蛋白预测的三级结构中有大量的无规则卷曲和α-螺旋，只有少量β-转角，因此，可认为该预测结果可信度高。

3.3 PcUER1系统发生树构建 将PcUER1基因序列的同源氨基酸序列与NCBI数据库进行比对，结果表明，多花黄精多糖中UER1酶基因同源序列众多，比对结果中同源性相似度最高的为百合科虎眼万年青(ANK57461.1)，在比对结果中未发现百合科的其他种属。以包含PcUER1编码蛋白在内的19种不同植物UER1氨基酸序列为模板，采用MEGAX软件创建UER1系统进化树(见图5)，以邻位相连为统计方法，辅以配对删除法对缺失数据进行处理。其中，多花黄精与百合科虎眼万年青[

Albuca

bracteata

(

Thunb

.) J. C. Manning & Goldblatt]同源性最高，达到92.03%，由于虎眼万年青和多花黄精同属于百合科植物，故其同源性最高。由进化树结果可知，多花黄精与伞形科黄胡萝卜、旋花科三裂叶薯等亲缘关系均较远。

图5 PcUER1的系统进化树

表2 多花黄精不同组织黄精多糖含量检测结果

4 讨论

黄精多糖是多花黄精的主要有效成分，已有研究表明，黄精多糖是由多种单糖构成，包括鼠李糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等，这些单糖在后续糖基转移酶的作用下，形成其特征性多糖。在黄精多糖的合成途径中需要UDP-鼠李糖，UDP-鼠李糖是组成多花黄精多糖的重要成分。UDP-葡萄糖转换成中间产物UDP-6-去氧-4-酮葡萄糖后，PcUER1在含有NADPH的环境下催化合成UDP-鼠李糖，且PcUER1参与纤维细胞次生壁的合成。PcUER1基因可能通过诱导某些特殊细胞壁多糖的合成和参与UDP-鼠李糖的合成，对黄精多糖的合成起到一定的作用。

UER1是多花黄精多糖中UDP-鼠李糖合成的关键酶基因，本研究以前期实验室测序获得的转录组数据为基础，设计引物对PcUER1进行克隆。经凝胶回收、载体连接与转化，在质粒提取后进行测序，确定了PcUER1序列，该基因序列长度为900 bp，编码299个氨基酸，进一步对PcUER1翻译的蛋白质进行测算，主要结构是α-螺旋，其次是无规则卷曲，由20种共299个氨基酸组成，分子量为33 510.25 Da，预测该蛋白较稳定，其理化性质较为稳定，在酵母等模式工程菌体内可存在较长时间，适合进行原核或真核异源表达。在NCBI数据库中检索PcUER1的同源基因，发现其与百合科虎眼万年青的UER1相似性较高。通过对PcUER1基因及其蛋白的结构与序列进行分析，并检索相关文献，发现PcUER1基因的活性位点有辅因子结合基序和催化四分体基序。采用实时荧光定量PCR对PcUER1基因的表达信息进行分析，结果在本次试验中实测情况与生物信息学数据吻合度较高，根茎中黄精多糖含量最高。Yin等研究表明，虎眼万年青的多糖中鼠李糖的合成是由RHS1与UER1协同作用，实时荧光定量PCR检测结果与黄精多糖含量检测结果有细微差异的原因可能是RHS1与UER1或UER1与其他基因的协同作用。

本研究为PcUER1多糖合成途径关键酶基因的克隆及其结构和功能的进一步研究提供了依据，也为将来多糖类生物合成途径的解析及调控机制的研究奠定了基础。