苓桂术甘汤对急性心肌梗死后大鼠肠黏膜屏障损伤的保护作用研究

翟梦婷，葛瑞瑞，王 翔，汤同娟，左梦雨，谷金繁，王 靓,2,3，周 鹏,2,3，黄金玲，2，3

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，安徽 合肥 230012；3.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

随着人口老龄化进程，中国心血管病患病率逐年升高，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的死亡率呈上升趋势，AMI成为城乡居民死亡的主要原因之一。临床上部分AMI患者会出现腹痛、腹泻、恶心、呕吐等胃肠道症状，易被误诊为急腹症。研究发现，AMI患者出现胃肠道症状与心排出量降低、肠道低灌注的缺血性损伤及肾素-血管紧张素系统激活、肠道血管持续收缩密切相关。因此，探寻保护AMI后肠道缺血性损伤、改善肠功能的方法具有重要意义。

苓桂术甘汤出自汉代张仲景所著的《伤寒杂病论》，由茯苓、桂枝、白术和甘草4味中药组成，具有温阳健脾、利水化饮之功效。本团队既往研究发现，苓桂术甘汤能够抑制心肌细胞氧化应激损伤及细胞凋亡，抑制AMI后慢性心力衰竭大鼠神经内分泌细胞因子的过度激活，降低血清血管紧张素Ⅱ、内皮素-1及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β水平，抑制模型大鼠心室重构，改善心功能。但其能否减轻AMI所致肠道缺血性损伤，保护肠功能有待深入探讨。因此，本实验在前期研究基础上，观察了AMI模型大鼠肠屏障功能变化及苓桂术甘汤对AMI大鼠肠黏膜屏障的保护作用。

1 材料

1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司[动物生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0003]。大鼠每5只一笼，饲养于安静且通风的房间，有充足的食物与水补给。本实验经安徽中医药大学实验动物中心动物实验伦理委员会审查、批准。

1.2 药物及试剂 茯苓(批号 2005181)、桂枝(批号 2005181)、甘草(批号 1911041)、白术(批号 2002202)：安徽普仁中药饮片有限公司，参考文献[6]方法，按原方质量比例4∶3∶3∶2，加入10倍量水，提取2次，每次1 h，制成干浸膏(4.8 g/g)，避光密封保存备用；D-乳酸(批号 MM-0180R2)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(批号 MM-0647R1)、TNF-α(批号 MM-0180R1)、IL-6(批号 MM-0190R1)和IL-1β(批号 MM-0047R2)ELISA检测试剂盒：武汉酶免生物科技有限公司；闭合蛋白(Occludin)兔单抗(批号 ab216327)：英国Abcam；带状闭合蛋白(zonula occludens-1，ZO-1)兔单抗(批号 AF5145)：中国Affinity；山羊抗兔IgG/HRP标记(批号 A21020)：北京中杉金桥生物技术有限公司；Trizol试剂(批号 15596026)：美国Ambion公司；逆转录试剂盒(批号 2690A)：日本宝日医生物技术有限公司；荧光定量PCR试剂盒(批号 KM4101)：美国KAPA Biosystems公司。

1.3 主要仪器 ATOM全自动酶联免疫工作站：意大利MAROCHE；FA2004B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；ECG-2303B数字心电图机：广州市三锐电子科技有限公司；YD-6L生物组织包埋机、YD-AB摊烤片机：金华市益迪医疗设备有限公司；HM325切片机：美国赛默飞世尔科技；FCM凝胶成像系统：美国Protein Simple公司；荧光定量PCR 仪：美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 AMI模型复制 参考文献[7]，采用冠状动脉结扎法，大鼠乙醚麻醉后开胸，选用6-0眼科缝合线结扎距左冠状动脉根3 mm处的冠状动脉左前降支，术后大鼠心电图Ⅱ导联S-T段抬高伴肢体导联R波高尖，视为模型复制成功，假手术组大鼠只穿线不结扎。

2.2 动物分组、给药剂量及方法 将模型复制成功的大鼠随机分为模型组(生理盐水)，苓桂术甘汤低、中、高剂量组(分别相当于临床成人等效量的0.5、1、2倍)，每组12只，另有12只仅穿线未结扎大鼠被设为假手术组。灌胃给予苓桂术甘汤(容积为10 mL/kg)，假手术组与模型组给予等容积生理盐水溶液。第28天大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，麻醉后腹主动脉取血，分离血浆，剖取心脏、回肠，备用。

2.3 观察指标与检测方法

2.3.1 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法观察大鼠心脏及回肠组织病理变化 根据模型复制后大鼠死亡率和课题组其他实验安排，随机取6只大鼠心脏及回肠组织放入4%多聚甲醛，固定后脱水包埋，切片(厚度约4 μm)，进行HE染色，封片，光学显微镜下观察大鼠肠组织病理变化。

2.3.2 ELISA检测血浆D-乳酸和LPS，回肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β，心脏组织TNF-α含量 根据模型复制后大鼠死亡率和课题组其他实验安排，随机取6只大鼠回肠组织，按照试剂盒说明，采用双抗体夹心法，在450 nm波长下测定各孔光密度，计算血浆中D-乳酸和LPS，回肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β，心脏组织TNF-α含量。

2.3.3 Western blot检测大鼠回肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达水平 根据模型复制后大鼠死亡率和课题组其他实验安排，随机取6只大鼠回肠组织，加细胞裂解液，提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳，80 V电泳30 min，120 V电泳90 min，转膜封闭各2 h，一抗4 ℃孵育至少12 h，二抗孵育2 h，曝光，用Image J蛋白条带分析软件进行分析。实验重复3次，计算大鼠回肠组织Occludin蛋白、ZO-1蛋白的相对表达水平。

2.3.4 实时荧光定量PCR法检测大鼠肠组织Occludin mRNA、ZO-1 mRNA的表达水平 根据模型复制后大鼠死亡率和课题组其他实验安排，随机取6只大鼠回肠组织，用Trizol提取总RNA，逆转录为cDNA后进行PCR扩增，采用2-ΔΔC法进行数据的相对定量分析。各基因引物信息见表1。

表1 Occludin、ZO-1的引物信息

3 结果

3.1 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠心脏组织病理形态的影响 假手术组大鼠心肌细胞排列紧密整齐，横纹、细胞核清晰；模型组大鼠心肌纤维肿胀且排列紊乱，有波浪型改变，炎症细胞浸润明显；与模型组相比，不同浓度的给药组在心肌细胞肿胀、排列结构情况、炎症细胞浸润等方面均有不同程度的改善。其中，以苓桂术甘汤高剂量组改善最为明显。结果表明苓桂术甘汤对AMI心肌缺血损伤具有明显保护作用。见图1。

3.2 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠回肠组织病理形态学的影响 假手术组肉眼下肠道无胀气，光学显微镜下观察绒毛形态正常，肠黏膜完整，腺体排列紧密。模型组肉眼下肠道胀气明显，肠壁水肿充血，光学显微镜下可见肠黏膜脱落，绒毛变短且稀疏，腺体减少且排列疏松，周围组织有散在红细胞，大量炎症细胞浸润；苓桂术甘汤低剂量组大鼠肠黏膜脱落，绒毛变细且形态异常，腺体较模型组多；苓桂术甘汤中剂量组大鼠肠黏膜略有损伤，腺体排列整齐且紧密，中性粒细胞减少；苓桂术甘汤高剂量组大鼠肠黏膜完整，肠道形态接近正常，中性粒细胞明显减少。见图1。

注：箭头所指的是小肠绒毛、小肠黏膜、腺体及中性粒细胞图1 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠心脏、回肠组织病理形态的影响(HE染色，10×20倍)

3.3 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠血浆D-乳酸和LPS含量的影响 与假手术组比较，模型组D-乳酸和LPS含量显著增加(

P

<0.05)。与模型组比较，苓桂术甘汤低、中、高剂量组D-乳酸和LPS含量显著减少(

P

<0.05)。与苓桂术甘汤低剂量组比较，中剂量组LPS含量减少、高剂量组D-乳酸和LPS含量均减少(

P

<0.05)。与苓桂术甘汤中剂量组比较，高剂量组D-乳酸和LPS含量均减少(

P

<0.05)。见表2。

表2 苓桂术甘汤对AMI大鼠血浆D-乳酸和LPS含量的影响

3.4 苓桂术甘汤对AMI后大鼠回肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠Occludin、ZO-1蛋白表达水平均显著降低(

P

<0.05)。与模型组比较，苓桂术甘汤低剂量组Occludin蛋白表达水平升高，中、高剂量组Occludin、ZO-1蛋白表达水平均升高(

P

<0.05)。与苓桂术甘汤低剂量组比较，高剂量组Occludin、ZO-1蛋白表达水平均升高(

P

<0.05)。见图2、表3。3.5 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠回肠组织Occludin、ZO-1 mRNA表达水平的影响 与假手术组比较，模型组Occludin、ZO-1 mRNA表达水平均显著降低(

P

<0.05)。与模型组比较，苓桂术甘汤低、中、高剂量组Occludin、ZO-1 mRNA表达水平均显著提高(

P

<0.05)。与苓桂术甘汤低剂量组比较，中剂量组ZO-1 mRNA表达水平升高，高剂量组Occludin、ZO-1 mRNA表达水平均升高(

P

<0.05)。与苓桂术甘汤中剂量组比较，高剂量组Occludin、ZO-1 mRNA表达水平均升高(

P

<0.05)。见表4。

注：A.假手术组；B.模型组；C.苓桂术甘汤低剂量组；D.苓桂术甘汤中剂量组；E.苓桂术甘汤高剂量组图2 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠回肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达水平的影响(Western blot法)

表3 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠回肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达水平的影响

表4 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠回肠组织Occludin、ZO-1 mRNA表达水平的影响

3.6 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠回肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β，心脏组织TNF-α含量的影响 与假手术组比较，模型组回肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β，心脏组织TNF-α含量均显著增加(

P

<0.05)。与模型组比较，苓桂术甘汤低剂量组回肠组织TNF-α和IL-1β含量降低(

P

<0.05)，中、高剂量组回肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β，心脏组织TNF-α含量均显著降低(

P

<0.05)。与苓桂术甘汤低剂量组比较，中剂量组心脏组织TNF-α和回肠组织IL-6、IL-1β含量降低，高剂量组回肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β，心脏组织TNF-α含量降低(

P

<0.05)。与苓桂术甘汤中剂量组比较，高剂量组回肠组织TNF-α、IL-1β，心脏组织TNF-α含量均显著降低(

P

<0.05)。见表5。

表5 苓桂术甘汤对AMI模型大鼠回肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β，心脏组织TNF-α含量的影响

4 讨论

AMI是引起心力衰竭和心源性死亡的重要原因之一，近年来心脏与肠道之间关系的研究受到广泛关注。AMI发病后，心肌缺血低氧而坏死，为清除坏死细胞碎片，炎症细胞向梗死区域募集，心肌组织中TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子释放增加。过度激活的炎症细胞因子，加重心肌损伤、心室重构，导致心脏形态结构和泵血功能异常，进而发展为心力衰竭。同时，由于心输出量减少，肠道血流量降低，肠黏膜缺血低氧而发生缺血性损伤，进而引发肠屏障功能受损。

肠黏膜屏障由机械、免疫、化学和生物4个结构与功能各异的屏障组成，将肠腔内容物与宿主有选择性地分离，阻止肠道内细菌、毒素入侵血液，维持机体稳态。D-乳酸是由肠道乳酸杆菌、拟杆菌属等多种肠道细菌发酵形成的代谢产物，在肠道黏膜屏障完整时，血液中D乳酸含量极低，当肠黏膜屏障功能受损时，大量D-乳酸透过肠黏膜屏障移行入血，血中D-乳酸水平可反映肠黏膜损害程度和通透性变化。革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的重要组成部分LPS在肠道通透性增加时，移位进入体循环，导致体内多种炎症递质如TNF-α、IL-6和IL-1β过度分泌、释放。肠黏膜屏障中机械屏障由肠上皮细胞及其细胞间连接构成，其中紧密连接是最重要的细胞间连接，属于不通透连接。紧密连接蛋白是紧密连接的主要组分，由Claudin蛋白、Occludin蛋白、连接黏附分子与ZO-1及细胞骨架等组成，能有效维持肠屏障功能及调节肠黏膜通透性。AMI时肠道缺血低氧，细胞间紧密连接结构被破坏，细胞间隙增大，导致肠黏膜屏障功能障碍。

AMI属于中医“胸痹”“真心痛”等范畴，系本虚标实之证。心者，君主之官，主血脉，赖阳气以推动血液在脉道中运行。心阳气虚、阴寒凝结是本病重要的病理机制，血瘀、饮停为标是其主要的病理环节。心与小肠相表里，二者经脉相连、气血相通、功能相互协调。心阳气虚、行血无力，则脏腑失其濡养，而致小肠功能失调。苓桂术甘汤内寓桂枝甘草汤，乃张仲景用以温心阳者，柯琴《伤寒附翼》视之为“补心阳之竣剂”；桂枝、茯苓相辅，则温阳化气，消饮宁心，王子接《绛雪园古方选注》所谓“通阳渗泄，保心气以御水凌”者也；白术协茯苓，培土以制水。

本实验研究发现，苓桂术甘汤既能减少AMI 4周后模型大鼠心肌组织炎症细胞浸润，减轻心肌纤维肿胀及排列紊乱，抑制心肌组织细胞因子TNF-α过表达，同时又能降低血浆中D-乳酸和LPS的水平，降低回肠TNF-α、IL-6、IL-1β含量，上调回肠Occludin、ZO-1蛋白及其mRNA表达水平。苓桂术甘汤的效应呈剂量依赖性，以高剂量的效应最优。结果表明苓桂术甘汤可通过促进肠道紧密连接蛋白及基因表达，保护大鼠肠黏膜屏障功能完整，降低肠道通透性，减少内毒素移位入血，抑制炎症细胞因子过度释放，减轻AMI后肠黏膜屏障损伤，保护肠道功能。本研究为苓桂术甘汤治疗AMI提供了实验依据，AMI后肠功能的动态变化及苓桂术甘汤的干预作用正在研究中。