改良羊水细胞培养方法在产前诊断中的应用

杜升烨，黄宪霞，王红梅

济南市人民医院重症产科，山东济南 271100

在目前临床医学中检测产前染色体疾病的主要方式是羊水细胞培养方式[1]。由于羊水细胞培养的方式难度比较大、操作技术要求比较高、羊水细胞培养的时间长和培养成功率不高等问题，因此很多医疗机构均未实施羊水细胞检测的工作[2-4]。随着科学的发展，医疗水平也随之提高，近年来，许多研究团队研究和改良了羊水细胞培养技术[5]。该文为探讨分析改良羊水细胞培养方法在产前诊断中的应用效果，便利选择2019 年1—11 月来该院妇产科临床资料上显示有遗传性染色体不良妊产或高危的200 例孕妇作为研究对象，实施羊膜腔穿刺术抽取羊水，然后使用改良的传统羊水培养方式和改良的原位细胞培养方式进行培养，研究结果取得了较高的成果，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

便利选择来该院妇产科临床资料上显示有遗传性染色体不良妊产或高危者等200 例孕妇作为研究对象。研究对象的年龄 22～45 岁，平均年龄（39.32±2.35）岁；孕周为 18～32 周，平均孕周为（28.75±1.45）周。

1.2 纳入标准

①临床诊断显示遗传性染色体不良妊产、高危者、高年龄或B 超显示异常的孕妇； ②均无严重并发疾病和严重感染性疾病； ③该次研究经过了医院伦理委员会的批准和同意；④患者无行为、组织和认知障碍；⑤患者和家属同意后对患者实施羊膜腔穿刺术。

1.3 方法

使用 B 超（B-scan ultrasonography）进行定位，然后在无菌的情况下进行穿刺操作[6]。按照改良的传统羊水培养和改良的原位细胞培养的操作方法，分别对患者实施羊水采集。

改良的传统羊水培养： 对采取的羊水细胞进行离心操作并将上清液丢弃，保存5 mL 羊水细胞层，使用滴管接种在的培养液中，放入培养箱进行培养，4 d 后进行采集，一般5 d 换1 次培养液。在收集前2 h 使用秋水仙素滴入培养皿中，然后静止放置2 h，将羊水细胞停止分裂。

①针对胎质羊水的处理方式： 羊水的沉淀中含有大量的胎质羊水，细胞培养96 h 后，观察羊水细胞是否出现贴壁的现象，出现贴壁现象后摇动培养皿对培养皿进行换液处理。

②针对严重血性羊水的处理方式： 在羊水细胞培养过程中如果出现血性羊水，则往羊水中加入无菌肝素，观察羊水细胞是否出现贴壁的现象，出现贴壁现象后摇动培养皿对培养皿进行换液处理。

③针对羊水细胞克隆老化的处理方式： 采用原瓶消化法的方式来处理羊水细胞克隆老化。将培养液中的上清液倒出，使用无菌生理盐水对细胞面进去清理，然后使用生理盐水胰酶进行消化，直至细胞脱落后加入新的培养液，然后放入培养皿中进行培养，48 h 后收取培养皿细胞。

④针对羊水细胞的收获方式： 沿着培养皿轻刮细胞，并使用吸管对克隆细胞进行收取[7]。然后使用生理盐水对细胞进行冲洗，将收取的细胞进行离心实验，将上清液丢弃并保留沉淀0.5 mL。

低渗：将5 mL 的氯化钾加入悬液管中，混匀后放入37℃的水浴箱中低渗10 min，之后进行离心实验，将上清液丢弃并保留沉淀0.5 mL，加入固定液摇匀，然后进行离心实验，将上清液丢弃并保留沉淀0.5 mL，再进行固定，1 h 后放入冰箱中。

滴片： 进行离心实验，将上清液丢弃并保留沉淀0.5 mL，然后加入固定液，然后将1 滴悬液滴入玻璃片上，风干后，使用显微镜对观察细胞中染色体的情况。

改良后的原位细胞培养： 首先进行离心实验并丢弃上清液保留沉淀0.5 mL，加入一定量的羊水细胞培养液，摇匀后放入培养箱中实施培养。2 d 后进行采集，一般5 d 换1 次培养液。

低渗： 丢弃上清液并使用生理盐水对细胞面进行清洗，连续清洗2 次后，将氯化钾（0.075 mol）加入低渗30 min；预备固定，将培养液中加入定量的固定液，摇匀后静置5 min。固定：倒出低渗的液体和预备固定的液体，然后加入固定液，摇匀后静置30 min 后，倒出固定液，连续固定2 次即可。

显带：在76℃下对研究对象进行烤片，然后使用生理盐水胰酶进行消化，将G 显带实施染色，根据相关标准对核型进行分析。

1.4 统计方法

应用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计数资料以频数和百分比（%）表示。

2 结果

①对200 例进行培养，一次性羊水穿刺培养成功了180 例，成功率为90.00%，二次羊水穿刺成功培养了10 例，成功率为5.00%，总培养成功了190 例，总成功率为95.00%，其中培养的时间为4～6 d，收获最短的时间为4 d，最长的时间为6 d。其中培养失败的6 例因为细胞不贴壁现象。

②在卫生部门相关规定的基础上，使用改良的传统羊水培养方式和改良的原位细胞培养方式进行培养，延长了羊水细胞检查的孕周时间，而且有效减少了胎儿和孕妇实施染色体检查的危险，胎儿和孕妇的生命安全也得到了有效的提高，见表1。

③对可行染色体核型190 例分析发现，出现染色体异常核型现象的有18 例，且染色体异常检出率为9.47%，其中，平衡易位有 5 例，占染色体异常的27.80%；三体综合征有7 例，占染色体异常的38.89%；其他结构异常的6 例，占染色体异常的33.33%。

表1 不同培养方式下羊水细胞培养的效果

3 讨论

羊水细胞培养是在产前诊断的一种综合性的技术手段[8]。羊水细胞是否可以高质量的培养和收获是实施羊水染色体核型分析最重要的部分。在传统培养过程中，将沉淀的细胞都接种在培养皿中，并使用秋水仙素培养后对细胞实施收获[9]。然后将细胞实施离心等操作。在这些实验操作的环节中，由于培养的时间比较长，因此极容易造成污染，一旦发生污染现象，就无法进行补救。而且在传统羊水细胞培养过程中，大大小小的操作非常多，有可能因为一个微小的操作失误就会导致实验不成功，从而无法得出正确的结论。

由于导致羊水细胞培养失败的因素有很多。近年来有研究对象提出，在培养过程中将培养液分为两部分，并加入新鲜的培养液进行培养[10]。还有研究提出[11]，将培养皿放入冰箱中然后实施分离细胞进行培养等。提出的方法均存在者不同程度的局限性。该次研究为了进一步分析改良羊水细胞培养方法在产前诊断中的应用效果，选择来该院妇产科临床资料上显示有遗传性染色体不良妊产或高危者等孕妇作为研究对象，实施羊膜腔穿刺术抽取羊水，然后使用改良的传统羊水培养方式和改良的原位细胞培养方式进行培养，研究结果显示，对200 例进行培养，培养成功了190 例，成功率为95.00%，其中培养的时间为4～6 d。对可行染色体核型190 例分析发现，出现染色体异常核型现象有18 例，且染色体异常检出率为9.50%。其中，平衡易位有5 例，占染色体异常的27.80%；三体综合征有7 例，占染色体异常的38.89%；其他结构异常的6 例，占染色体异常的33.33%。充分证明了改良的传统羊水培养方式和改良的原位细胞培养方式能够有效预防染色体异常患儿的出生，从而响应了我国优生的政策，改善了因染色体异常患儿造成的不必要的负担。

该次改良羊水细胞培养方式比传统羊水细胞培养方式不同的是针对不同孕周实施相应的检测和培养，优点：①操作前对样本实施留存操作，避免出现原材料的浪费现象[12]。②对处理脱落细胞的中优化了操作流程。③优化了对染色体的收获操作，大大降低了交叉污染的概率也提高了试验的效率。④比传统羊水细胞培养方式操作步骤少，在操作重对脱落的细胞直接实施低渗，从而减少了离心操作，缩短了实验时间，而且改良后羊水细胞培养方式成功率比传统的羊水细胞培养方式高。

该次研究数据与李付广等人[3]研究结论相符，对羊水细胞培养135 例，全部一次性羊水穿刺培养成功,成功率为100%。对可行染色体核型135 例分析发现，9 例异常染色体核型（6.6%）、12 例多态性（8.9%）。对 80 例实施脐带血细胞培养，培养成功的有78 例，成功率为97.5%,对可行染色体核型78 例分析发现，检出异常核型 8 例（10.3%）、多态性 8 例（10.0%）。充分证明了改良羊水细胞培养技术对于产前诊断中有着积极的作用。

综上所述，改良的传统羊水培养方式和改良的原位细胞培养方式均提高了收获的成功率，减少了细胞培养的时间，且检测分析的染色体核型比较多。因此改良的传统羊水培养方式和改良的原位细胞培养方式能够提高培养率，提高对胎儿染色体疾病临床诊断的准确率，因此改良羊水细胞培养方法值得在临床产前诊断中应用。