丁香精油对黑色素细胞抗氧化特性及黑色素生成的影响 ①

刘玉荣，曹雅菲，雒洋洋，高 怡，刘景源，刘君星

(1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

丁香(FlosCaryophylli)系桃金娘科蕃樱桃属植物丁香(Eugenia Caryophyllata Thunb.)的干燥花蕾,又称公丁香。实验结果表明丁香精油具有良好的抗氧化活性和抑菌[1～3]。目前国内外对丁香的研究与应用主要集中在食品的抗氧化抑菌、化妆品和医药卫生方面[4～7]。自科学家们开始对精油的研究，精油的各种功效逐渐显露，但是精油对皮肤美白的作用研究的时间并不久[8]。随着提取工艺的不断提升，各种提取方法之间的对比，我们可以得到含抗氧化物质更多的精油[9]。植物精油作为一种天然的酪氨酸酶抑制剂，具有显著的促透皮吸收能力和酪氨酸酶抑制活性，而且具有独特的芳香气味，应用前景广阔[10]。本实验基于黑色素细胞评价体系探索了丁香精油对黑色素细胞活力的影响、抗氧化损伤作用及对其生成黑色素的抑制作用，为进一步扩大丁香精油在食品、药品和化妆品等领域的应用提供数据支撑。

1 实验材料

主要试剂及仪器：丁香精油(北京华迈科生物技术有限责任公司);人造黑素(Sigma公司);左旋多巴(成都普瑞法科技开发有限公司);总SOD检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);BCA总蛋白定量测试盒(上海碧云天生物技术有限公司);普通倒置显微镜(日本Olympus公司)。

2 实验方法

2.1 丁香精油对黑色素细胞的毒性

MTT 法检测细胞活性: 当细胞排列较紧密、80%左右融合后制作细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液，每孔 200μL接种于 96孔细胞培养板。培养24h细胞贴壁后吸出原培养液，实验组加入浓度分别为10.45mg/mL、2.09mg/mL、0.418mg/mL、0.084mg/mL、0.017mg/mL、0.003mg/mL丁香精油的培养基稀释液，每种浓度的药物设置6个复孔，另设一组对照组和空白组，加入等量的不含药物的培养液。继续培养 24h、48h后，取出培养板，吸出培养液，每孔加入100 μL培养基和20μL的MTS，37℃条件下继续孵育1 h。放入酶标仪中,在 450nm波长下测定各孔吸光值，记录数据，进行统计学分析。

2.2 抗氧化损伤

2.2.1 细胞内sod活性测定

取适量细胞接种于6孔板，第二天细胞贴壁后加入常规培养液或上述最佳作用浓度的药物共同处理48h后，按试剂盒说明书通过多功能酶标仪测定。

2.2.2 细胞内ros测定

取适量细胞接种于96孔板，第二天细胞贴壁后加入常规培养液或上述最佳作用浓度的药物共同处理48h后，按试剂盒说明书通过多功能酶标仪测定。

2.3 丁香精油对黑色素生成的影响

2.3.1 细胞内黑色素含量的测定: 取对数生长期细胞，用胰酶消化，制成1.2×105个/mL，按每孔2mL接种于 6 孔培养板， CO2培养箱培养24h。加药后继续培养 48h，用PBS(pH7.4)洗2次，每孔加100μL细胞裂解液，冰上裂解30min，12000r/min离心15min，弃上清，沉淀物中加150μL含10% DMSO 1mol/L的NaOH溶液，80℃恒温水浴保温30min。酶标仪405nm测定吸光度值，以人造黑素为黑色素标准品设置的标准曲线计算黑色素含量。黑色素抑制率=加药组黑色素含量/对照组黑色素含量×100%。

2.3.2 细胞内酪氨酸酶活性测定: 采用多巴氧化法，取对数生长期细胞，用胰酶消化，制成1.2×105个/ mL，按每孔2mL接种于6孔培养板，CO2培养箱培养 24h。加药后继续培养48h，去上清液，用PBS(pH7.4)洗2次每孔加100μL细胞裂解液，冰上裂解30min，12000r/min离心15min，取上清90μL，加入0.1% L-多巴溶液10μL，37℃反应30min，测定490nm吸光度值。酪氨酸酶相对活性=加药组OD值/对照组OD值×100%。

2.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行分析处理，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有显著性。

3 结果

3.1 不同浓度丁香精油对黑色素细胞活力的影响

因10.45mg/mL组精油浓度较大沉淀于板底，影响吸光度，不计入在内。与空白组(0mg/mL) 比较，2.09mg/mL、0.418mg/mL、0.084mg/mL组的细胞活力显著减弱(P<0.05或P<0.01)，且抑制率与药物浓度正相关。由此选择0.084mg/mL作用48h为后续实验的作用剂量。见图1。

3.2 不同浓度丁香精油对黑色素细胞内T-SOD、ROS的影响

与对照组相比，加药组各组细胞内T-SOD活力均有不同程度的增加，当精油浓度>0.418mg/mL以后SOD逐渐下降，差异有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组ROS显著升高，加药组细胞ROS有不同程度的下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2～3。

3.3 不同浓度丁香精油对黑色素细胞黑色素含量、酪氨酸酶活性的影响

各组黑色素含量下降明显，精油浓度与抑制率成正比，差异有统计学意义(P<0.05)，且有明显差异(P<0.01)。各组酪氨酸酶活力均有不同程度下降，差异有统计学意义(P<0.05)且有明显差异(P<0.01)。见图4。

图1 不同浓度丁香精油对黑色素细胞的抑制率

图2 丁香精油对黑色素细胞内T-SOD的影响

图3 丁香精油对黑色素细胞内ROS的影响

图4 丁香精油对黑色素细胞黑色素含量、酪氨酸酶活性的影响

4 讨论

丁香精油具有消炎、止痛、抗病毒、抗癌、抗氧化等药理活性，同时具有很强的抑菌活性，是优良的天然食品防腐剂来源[11]。所以近些年来丁香精油在食品保鲜，抗菌等方面有很多研究。因皮肤对脂溶性物质渗透较高，所以精油有较高的透皮吸收率[12]。而且传统的皮肤美白剂，可能会导致皮肤过敏、腐蚀等危害，因此从天然植物中提取功效成分延缓皮肤衰老，已成为目前护肤产品开发的主要趋势，产品也深受消费者喜爱[13,14]。皮肤黑化、雀斑、褐斑和老年斑的出现,都与体内酪氨酸酶和过氧化氢酶的活性增高密切相关[15]。皮肤美白剂的美白机理主要在于抑制新的黑色素生成，加速已有黑色素的分解。皮肤美白机理主要是：(1)抑制有关黑色素生成的相关酶。与黑色素生成主要相关的是以下三种酶：酪氨酸酶(TYR)、5，6-二羟基吲哚羧酸氧化酶(TRP-1)、多巴色素异构酶(TRP-2)，因此研究药物的美白功效可以研究通过其对这三种酶的抑制能力。(2)抑制黑色素细胞增殖。(3)抑制黑色素转移。(4)抑制黑色素合成相关基因的表达。(5)黑色素的分解与代谢[16]。

本文验证了丁香精油的抗氧化活性并研究了丁香精油对对小鼠表皮黑色素细胞内黑色素生成的影响及酪氨酸酶活性的抑制作用，但关于丁香精油抑制黑色素生成的作用机制尚未探索，希望在之后的实验中能明确与黑色素生成密切相关的酶的mRNA、DNA表达水平，使得丁香精油的皮肤美白作用机制研究更加完善。随着精油提取工艺、成分分析及护肤品制作工艺的提升，了解更多含香组分或其它可用于化妆品领域的天然成分，调配与化妆品香水等产品中，相信丁香精油在皮肤美白等领域的应用会更加广泛。