脐带间充质干细胞对小鼠急性肝损伤修复作用的研究 ①

王 琪，柳朝阳，张鹏霞，纪洪兵，殷佳辉，赵德阳，岳 渊，张 涛

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯市传染病医院,黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

间充质干细胞(MSCs)具有可塑性及自我更新和分化能力，目前对间充质干细胞研究较多的是骨髓间充质干细胞，但骨髓获取具有创伤性，经进一步研究发现MSCs具有多种不同来源，几乎可以在所有的组织中找到，脐带是一种容易获得的组织资源，取材简便没有创伤性，易于扩增与分离培养[1]。长期保存也具有稳定性，在炎症组织损伤和某些癌症疾病中作为组织再生的主要基质[2]。经证实，间充质干细胞可分泌大量具有免疫抑制作用的生物活性因子，这为异基因间充质干细胞的治疗提供了理论基础[3]。本研究对脐带间充质干细胞进行分离培养及鉴定，并通过对小鼠腹腔注射脂多糖造急性肝损伤模型，随后腹腔注射MSCs对急性肝损伤小鼠进行治疗，从而对脐带间充质干细胞修复肝功能的能力进行全面研究。

1 材料和方法

1.1 材料

试验动物为6周龄雄性小鼠(北京华阜康生物有限公司)。脐带间充质干细胞培养所用的试验动物由中国农业科学院畜牧兽医研究所昌平试验基地提供，取3月胎龄的流产胎牛，选取脐带组织放置于含双抗的无菌PBS磷酸盐缓冲液中待用。

1.2 主要试剂

DMEM/F12 基础培养基，自制PBS，胎牛血清和山羊血清均购自美国Gibco公司，双抗(青霉素、链霉素)均购买于北京中杉金桥。一抗购自北京博奥森公司，FITC标记兔抗小鼠，购自北京康为试剂公司。Trizol试剂购买于Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。

1.3 方法

1.3.1 全培

DMEM/F12基础培养基(按说明书配置)，胎牛血清10ng/mL，bFGF10ng/mL，EGF10ng/mL，1%丙酮酸那，1%非必须氨基酸，1%青链霉素(双抗)，混匀后除菌(滤膜)放冰箱待用。

1.3.2 脐带间充质干细胞的分离培养

组织贴壁法培养胎牛脐带间充质干细胞75%乙醇喷洒流产胎牛胎盘消毒，无菌条件下用高压灭菌后的眼科镊子和眼科剪将胎盘解剖选取脐带组织，放入到含1%双抗的无菌预冷PBS中,随后转移至紫外照射15min的无菌超净工作台上，将血管和其他组织剔除干净，于PBS中反复漂洗8～10遍去除血细胞。将脐带剪为2mm×2mm左右的组织块, 均匀的贴在培养皿底面, 加入1mL的胎牛血清保持脐带组织湿润与贴壁, 将培养皿转移至37℃、5%CO2细胞培养箱中, 放置1h后，加入3mL全培，静止3d后每隔两天换液一次，当细胞爬满皿底2/3即消化传代。

1.3.3 免疫荧光坚鉴定间充质干细胞

取第5代纯化后的脐带间充质干细胞接种到六孔板中，PBS冲洗两遍后用4%多聚甲醛固定，经TritonX-100通透山羊血清封闭后加入一抗，4℃冰箱避光孵育过夜，次日取出六孔板加入FITC标记二抗，表面标记物为VIM、NES、CD44、CD70、CD90和CD105。PBS洗涤,激光共聚焦显微镜拍照。

1.3.4 动物模型制备

准备54只小鼠分为3组，每组18只小鼠随机分为细胞移植组，对照组和损伤组，对小鼠进行适应性饲养15d。腹腔注射途径给小鼠注射10mg/kg矿物油(对照组)和10mg/kg脂多糖(损伤组和细胞移植组)。随后给细胞移植组小鼠腹腔注射4.6×106/皿脐带间充质干细胞，选取时间节点为6h，24h，48h处理小鼠。

1.3.5 小鼠血清学和肝组织分析

抽取小鼠全血，低速离心机离心小鼠血液取上层血清，通过血清学检测对小鼠酶水平进行分析，分别检测肝功能生化指标ALT、AST、ALP、GGT。通过苏木精 - 伊红(HE)染色法评估肝损伤与细胞修复作用。

2 结果

2.1 组织块贴壁法MSCs的形态学观察

通过显微镜观察脐带组织块贴壁法,在第3天组织块周围游离出细胞见图1A,在分离培养的第10天组织块周围爬满细胞, 细胞形态多为梭形或长梭形，见图1B ,当细胞贴壁率达到80%时可以消化传代，传代后细胞为梭形或长梭形,见图1C～1F。

A 、B分别为为P0第3天和第10天C、D、E、F为P1～P4

2.2 免疫荧光鉴定

通过免疫荧光法检测脐带间充质干细胞表面标志物VIM，NES、CD44、CD73和CD105，见图2，结果显示均为阳性表达，证明分离培养出的细胞确实是MSCs，可用于下一步小鼠损伤后的细胞移植治疗实验。

(A、D、G、J为绿色荧光(FITC)胞质染色； B、E、H、K 为 DAPI胞核染色； C、F、I、L为FITC与DAPI的叠加图)

2.3 小鼠苏木精 - 伊红(HE)染色法评估和血清学检测

2.3.1 细胞移植后小鼠肝脏切片的免疫组织化学分析：细胞移植后48h，做小鼠肝脏切片，用10%福尔马林固定并用石蜡包埋，做肝脏的组织学分析，用苏木精-伊红(HE)染色评估，见图3。

A为LPS注射48h肝组织切片；B为细胞移植后48h肝组织切片

2.3.2 注射LPS后48h，小鼠表现出严重的肝损伤。与未受伤的小鼠(对照组)相比，LPS腹腔注射发生肝损伤的小鼠(损伤组)对比，ALT、AST、ALP、GGT增加，急性时相反应蛋白CRP升高。随后将脐带间充质干细胞腹腔注射到急性肝损伤模型小鼠体内，细胞移植后48h ALT、AST、显著降低，ALP、GGT水平降低，CRP下降，证明脐带间充质干细胞对急性肝损伤小鼠有治疗能力。

3 讨论

肝脏暴露于许多因素下，例如药物、病毒，这些因素可能会导致肝脏病变包括慢性肝炎和肝硬化，肝硬化已成为常见病[4]。在大多数情况下，这些疾病会导致肝细胞癌，最后导致器官衰竭，出现慢性炎症，纤维化，并且不再具有任何再生能力,肝癌的死亡率居肿瘤第二位[5]。迄今为止，唯一有效的治疗方法是肝移植，但由于供体数量有限和器官排斥，因此不能被广泛应用。另一种治疗肝衰竭的方法是干细胞。治疗肝损伤的主要干细胞是间充质干细胞(MSCs)，可以从不同来源获得，例如骨髓[6]、脐带血[7]、羊水[8]、头皮组织[9]、胎盘[10]和脂肪组织[11,12]。经统计每年因肝脏疾病死亡的患者被低估，病毒性肝炎和肝胆癌引起的与肝脏有关的发病率和死亡率增加，脐带间充质干细胞移植后可以改善肝脏功能，这一点已经通过肝脏组织切片及血清学检测数值的变化得到证实。证明脐带间存在干细胞移植可能在肝病动物模型和肝病治疗的临床环境中具有广泛的治疗功效，对建立干细胞移植具有重要意义。