肝硬化患者外周血miR-122、185的表达 ①

于俊洲，李卫明

(佳木斯市传染病院，黑龙江 佳木斯 154007)

肝硬化是多种慢性肝病的重要临床结局。代偿期无明显症状，一旦失代偿则以门脉高压和肝功能严重损害为特征，病人常因消化道出血、腹水、脓毒症、肝性脑病、肝肾综合征和癌变导致多脏器功能衰竭而死亡。代偿失代偿病人5年生存率分别约84%和14%。代偿肝硬化和慢性肝炎的临床表现相似。通常血常规、肝功[1]等现行的实验室检查难以鉴别。B超、CT、核磁共振提示肝表面不光滑、脾厚，均非特异。虽胃镜可知食道胃底静脉曲张，但是和肝穿刺活检一样存在风险，而且单个肝组织活检标本不一定能全面反映肝脏整体纤维化程度。需要新的血液生物标志物来鉴别诊断。

基因理论是生物医学的重心。人类大部分疾病都与基因异常有关。微小核糖核酸是不编码蛋白质的RNA而参与转录后调控[2]，它与mRNA的短的互补序列结合，在转录产物的3＇UTR区，即非翻译区。要么降解产物，要么抑制翻译过程，最终使靶蛋白降低，产生生理或病理效应。目前，微小核糖核酸是很多疾病诊疗新的希望。miR-122是肝内特异表达的微小RNA，miR-185是参与广泛病理过程的微小RNA，国内外对其做了部分研究，但是各家数据不一。鉴于早期肝硬化的及时诊断意义，本院课题组拟对肝硬化的微小RNA作进一步研究。

1 材料和方法

1.1 主要仪器及试剂盒

实时荧光PCR仪(ABI7500)；全自动化学发光免疫分析仪(Mindray)。miRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)；柱式microRNA提取试剂盒；miRNA第一链合成试剂盒(加尾法)。

1.2 标本采集

随机选2018-10～2019-10佳木斯市传染病院确诊代偿期肝硬化住院患者48例作为肝硬化组，纳入标椎：符合2019年中华医学会代偿期肝硬化诊断依据(符合四条之一)：(1)组织学标椎；(2)内镜示消化道静脉曲张，除外非肝硬化门脉高压；(3)B超或CT提示：脾大、门静脉内径≥1.3cm；肝脏硬度测定(LSM)符合诊断界值；(4)符合以下2条：①PLT<100×109/L；②血清白蛋白<35g/L；③INR>1.3或PT延长；④APRI评分>2。另选取41例确诊慢性肝炎患者(乙肝26，丙肝8，其他7)作为肝炎组；再选取体检中心健康体检者36例作为对照组；以上研究对象均空腹8h后抽取肘静脉血4管，其中2黄管取血清检测生化和肝纤维化等指标；1紫管查血常规；1红管立即送工作台抽提全部小RNA后，所得溶液置于-70℃保存。

1.3 检测方法

化学放光免疫分析法检测血清中透明质酸(HA)和Ⅳ型胶原(CⅣ)等指标，常规检测生化、血常规。

物品去RNA酶处理，冰上操作。Poly(A)加尾反应和cDNA合成同步进行，所得cDNA于4℃冰箱保存。

冰上配20μL反应体系，每个模板配4个；miR-122-3P,miR-122-5P，miR-185-5P，U6(核内小RNA)。4体系上游引物不同，miRNA122,185为成熟体引物(miRBase)，U6为通用的U6内参的上游引物；下游引物共用；ROX染料校正液；DNA聚合酶；4种dNTP混合液；去RNA酶水等。预变性95℃,30S;变性95℃，5S;退火/延伸，60℃，30S;变性退火/延伸共40个循环，记录循环阈值Ct，用2-ΔΔCt 计算比率做相对定量。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0对数据分析，完全随机设计方差分析(单因素方差分析one way ANOV),相关回归方法描述推断，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

汇总分析各组样本血液指标，前白蛋白、血小板、总胆红素、球蛋白、总胆汁酸、转氨酶等提示早期肝纤维化的倾向均不理想，未显示统计学意义。对比正常组，肝炎组和肝硬化组HA、CⅣ血清含量均升高,全血miR-122表达下降,miR-185表达升高。

肝炎组和肝硬化组比较，HA和CⅣ差异无统计学意义。miR-122-3P、miR-122-5P表达量差异无统计学意义。

肝硬化组合正常组比较，HA和CⅣ差异有统计学意义(P<0.05)；miR-185-5P差异有统计学意义(P<0.05)。见图1～3。

图1 miR-122-3P各组外周血的表达

图2 miR-122-5P各组外周血的表达

图3 miR-185-5P各组外周血的表达

对比正常组、肝炎组，肝硬化组HA、CⅣ血清含量升高明显，而且与miR-185正相关,见图4～5。透明质酸相关更明显。

图4 miR-185与透明质酸相关分析

图5 miR-185g与Ⅳ型胶原相关分析

3 讨论

基因调控是生物表型发生和生物学行为的中心环节[3]，近年发现的miRNA揭示了全新的基因表达调控方式，它在调节那些“转录后或翻译初”修饰的基因起关键作用。深入研究miRNA可望触及生命的本质[4]。血中的丰富的miRNA分子可能作为方便的诊断材料[5]。miRNA可以在组织和血液及其他体液中稳定检出，对于内环境有公认的作用[6]。微小核糖核酸通常在体液被包裹于细胞外囊泡，例如外泌体、微囊泡，释放于各类细胞，用简单方法测量其分布可以作为生化指标[7]。

确定基因型与表型的联系是个性化的医学目的。而转录的3＇UTR区与微小RNA密切联系[8]，影响生命过程。微小RNA是新发现的参与基因表达的非编码RNA，存在于真核生物，其生物学特性是高度保守、时序表达和组织表达特异性[9]，大约19～25个核苷酸，非常之短，传统的trizol法提取长链RNA虽然可以，但是数十个核苷酸的短链RNA得率较低，有的反转录还用mRNA试剂盒，这样的短RNA反转录成cDNA较困难。本课题实验采用吸附柱抽提全部的小分子RNA，合成cDNA时再加上polyA腺嘌呤尾，用oligo(dT)胸腺嘧啶与之配对，这样反转录比较容易，根据微小RNA的成熟体序列设计特异引物，最后PCR扩增成功。

透明质酸(HA)广泛存在与细胞外间隙，主要在肝代谢，肝硬化病人由于成纤维细胞合成HA增加，而肝内皮细胞清除HA障碍，此二者导致血中HA升高，本实验注意到本采样部分代偿期肝硬化病人血中HA比其他血液指标更敏感，而且与血中miR-185-5P的表达正相关，说明二者可望成为早期诊断肝硬化的生物标志物。

本实验的不足是，可能肝病样本较少，比如需要分析肝癌，自身免疫性肝炎，华支睾吸虫病，其他原因导致的肝损害等的HA和微小RNA的情况，还有miR-122和miR-185的靶蛋白都需要进一步的研究。