大葱中凝集素的分离纯化与鉴定

◎ 潘晓梅

（白银市食品检验检测中心，甘肃 白银 730900）

凝集素是指非免疫来源的糖结合蛋白，其具有凝集细胞和沉淀糖复合物以及诱导癌细胞凋亡的能力。植物凝集素作为微生物与植物的共生介质，可防止植物病原菌对植物造成危害。随着研究的深入和发展，凝集素的药物价值也体现的越来越明显。同时，凝集素在抗动植物病毒、防御真菌、营养物质储存和生物固氮等方面也有着重要的作用。近年来，随着对凝集素研究的展开，人们已经越来越认识到凝集素的重要性，其在免疫学、肿瘤、生殖生理和细胞生物学等许多方面都得到应用，在医药、农业上呈现出巨大的应用前景。

大葱具有大蒜素、果胶等多种物质，具有抗菌、抗病毒、防癌及抗癌等生理作用，而对大葱中植物凝集素的研究尚未开展。本实验对大葱中的凝集素进行分离纯化和鉴定，为大葱的生理活性研究提供理论基础[1]。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

MJ-176NR 高速组织捣碎机（松下电器产业株式会社）、KDC-160H 冷冻离心机（科大创新股份有限公司）、600型恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）、DEAE-52 离子交换柱（2.6 cm×40 cm，上海沪西分析仪器厂）、Biologic DuoFlow 中高压柱层析系统（美国伯乐公司）、DYCP-12c 电泳仪（北京六一仪器厂）、Mini-PROTEAN 3 垂直平板电泳槽（美国伯乐公司）、100 μL 微量进样器（上海安亭微量进样器厂）以及HI 2210 pH METER pH 计（意大利哈纳仪器公司）。

1.2 材料与试剂

大葱（产源地山东）、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸铵、盐酸、95%乙醇、考马斯亮蓝G250、葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、氨水，冰醋酸、甲醇、甘油、巯基乙醇、溴酚蓝、甘氨酸、DEAE 纤维素（52）、十二烷基硫酸钠（SDS，≥99.0%）及三羟甲基氨基甲烷（Tris，≥99.9%），所用试剂均为分析纯。

生理盐水；饱和硫酸铵溶液（pH7.0）；25 mmol·L-1Tris-HCl 缓冲液（Tris buffer saline，TBS）；磷酸缓冲盐溶液（PBS，0.017 5 mol·L-1，pH6.7）1 000 mL；子交换层析所用试剂：磷酸缓冲液（pH7.4，0.15 mol·L-1），0.05 mol·L-1Tris-HCl 缓冲液；SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳试剂凝胶贮液；0.05 mol·L-1pH8.0 Tris-HCl缓冲液；分离胶缓冲液；电极缓冲液（3 g Tris、14.4 g甘氨酸、1 g SDS、ddH2O 定容至1 000 mL）；样品缓冲液；过硫酸铵（AP）溶液；染色液；洗脱液；标准蛋白（次高分子量）；浓缩胶缓冲液；固定液；阿氏液（Alsevers，提前配制[2]）。

1.3 透析袋的处理

将透析袋剪成15 cm 长度，先用50%乙醇浸泡20 min，去除表面的油脂类物质；再用0.01 mo1·L-1Na2CO3和0.01 mo1·L-1EDTA 煮沸30 min，去除表面的重金属、盐等杂质。处理好的透析袋浸入蒸馏水中，保存在冰箱中备用。

1.4 DEAE 纤维素的活化处理

活化纤维素一般按样品的蛋白质量进行计算，是蛋白质量的10 ～15 倍。取DEAE 纤维素1.5 g，溶解于0.1 mol·L-1NaOH 溶液中，浸泡过夜，盛装于锥形瓶中；布氏漏斗上减压过滤，蒸馏水重复清洗至pH8.0左右，抽干；用0.1 mol·L-1HCl 溶液浸泡30 min，用蒸馏水清洗至pH6.0 左右，抽干；BS（0.017 5 mol·L-1，pH6.7）浸泡3 h；倾去微细不沉降的悬浮颗粒，加入PBS（0.017 5 mol·L-1，pH6.7）使容积为沉淀体积的1.5 倍。

1.5 大葱凝集素的分离纯化

1.5.1 粗提取液制备

大葱洗净粉碎匀浆，取上清液，加入硫酸铵近约60%饱和度，4 ℃冷藏静置过夜，5 000 r·min-1离心20 min 弃去上清液，取沉淀得到大葱蛋白粗提取产物。将沉淀用Na2HPO4-Na2HPO4（pH7.4）缓冲液溶解后，离心去沉淀取上清液，用Na2HPO4-Na2HPO4（pH7.4）缓冲液透析除去硫酸铵，奈氏试剂检验完全没有硫酸铵时为透析终点。再用聚乙二醇进行样品浓缩至体积≤5 mL，准备上样层析。

1.5.2 DEAE-离子交换层析

取浓缩液上样DEAE-52 作为固定相（1.5 cm×30 cm），活化后的层析柱用0.05 mol·L-1Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡，用0 ～800 mmol·L-1Tris-HCl溶液进行离子强度线性梯度洗脱，洗脱处理温度25 ℃，流速为1 mL·min-1，用1.5 mL 离心管收集不同时间段内流出的洗脱液，得到层析分离液，每管洗脱液对应标号，洗脱完成后-20 ℃保存。

1.5.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

清洗玻璃板，制备模具；按表1 配方分别配制分离胶和浓缩胶；在浓缩胶聚合完成后（30 min），拔梳子，冲洗加样孔，把含胶的模具放入电泳槽中，加入电极液至没过加样孔；上样量根据蛋白浓度确定，为20 μg总蛋白；电压恒定在100 ～150 V；待溴酚蓝快走到分离胶的底部，准备电转移；将胶置于固定液中浸泡30 min 后将分离胶浸入染色液中染色30 min；取出分离胶，先用蒸馏水漂洗一次，浸入脱染液中脱染，室温浸泡凝胶或37 ℃加热使其脱色，更换脱色液，直至出现清晰的电泳带为止；以各标准样品迁移率做横坐标，分子量做纵坐标绘制标准曲线。

表1 浓缩胶和分离胶的配方表

1.6 大葱凝集素活性鉴定

自实验用白兔耳缘静脉采集血液，血样采集后立即与等体积的阿氏液混合，并用TBS 溶液（0.025 mol·L-1，含0.15 mol·L-1NaCl，pH7.5）润洗4 ～5 次，第1 次2 000 r·min-1离心3 min，第2 ～4 次3 000 r·min-1离心2 min，第5 次以3 000 r·min-1离心3 min，每次离心后小心弃去上清液，润洗后用TBS 配制成体积分数为2%的兔血红细胞悬液，4 ℃保存备用。

在96 孔“V”型微量血凝板中进行。先在每孔中加入25μL 的生理盐水，再向每孔中加入层析后的蛋白洗脱液25μL，并在一个孔中加入25μL 的生理盐水最为空白对照，将血球缓冲液依次加入每孔内。轻微振荡摇匀后静置15 min 进行观察[3-5]。与生理盐水的空白对照组进行对照，若有明显差异的即为有凝集活性。同样可观察凝集的红细胞边缘的齐整程度，若有参差即为有凝集活性；若边缘平整，则为红细胞受重力作用自动沉淀。

2 结果与分析

2.1 凝集素的分离纯化

由图1 可见，大葱提取液经过层析，紫外分析得到4 个特征吸收峰，分别为5、15、28 和41 号收集管，即分离得到4 组活性物质。

图1 层析后蛋白质在280 nm 处吸光值折线图

2.2 凝集素相对分子质量的测定

经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，测出该凝集素在凝胶中有色带，由图2 可计算出蛋白质的迁移率为49.2%，从标准蛋白的标准相对分子质量曲线求的凝集素的表观分子质量为41 kDa。标准蛋白分子量对照见图3，SDS 标准蛋白的相对分子质量标准曲线见图4。

图2 SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶图

2.3 凝集素活性鉴定

在96 孔板中分别加入具有特征吸收的层析收集液，生理盐水为空白对照组，同时用血浆凝固酶进行阳性对照，检测结果如图5 所示。左起第1 列为阳性对照组，向右分别依次为5、15、28 和41 号收集液，空白对照组，血浆自然沉降组。

经凝血活性检测，对照空白对照和阳性对照结果显示，仅第4 个峰，即41 号管收集液具有较高的凝血活性。在观察凝血活性时，看到红细胞边缘模糊不是十分清晰的即为有凝集效应。边缘较为平整的与空白对照相近，即没有凝集活性。

图3 标准蛋白分子量对照图

图4 SDS 标准蛋白的相对分子质量标准曲线图

图5 96 孔板凝血性实验图

3 结论

食物中凝集素对抗癌药物的治疗作用有增益效果，同时也能提高癌细胞对抗癌药物的敏感性，因此凝集素被认为是十分重要的活性成分[6]。凝集素是具有不同分子量，且由不同物质分子组成的一类物质，具有极其丰富的多样性，因而不同植物的凝集素各有不同，研究前景十分广泛。

本实验通过生化基础实验操作对大葱中凝集素进行分离，通过凝血活性实验对分离物质进行鉴定，成功从大葱中分离出有效的活性凝集素物质。并通过电泳得到大葱中凝集素的表观分子质量为41 kDa，为大葱的食疗与生物营养价值研究提供了参考。