大黄素对自身免疫性甲状腺炎小鼠的作用机制研究*

张国平，李攀，胡通海，吴可人

（1.嵊州市中医院 外二科，浙江 嵊州312400；2.浙江中医药大学附属第一医院肝胆外科，浙江 杭州310000）

自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis,AT）主要是由免疫功能紊乱、环境及遗传等因素综合作用导致的自身免疫性疾病，是细胞免疫与体液免疫共同作用的结果[1-3]。AT 发病率不断上升，严重影响人们生活质量[4-5]。近年来，临床上针对AT 主要采用免疫抑制剂、糖皮质激素等治疗，但其效果并不十分理想，且对机体免疫功能造成较大损害[6]。而大黄素属一种蒽醌类衍生物，具有一定的免疫抑制作用。因此，本文研究旨在探讨大黄素治疗AT 小鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60 只SPF 级昆明小鼠，雌性，适应性饲养1 周，湿度（55±10）%，温度（23±2）℃，自由饮食，购自辽宁实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK2017-0001，动物使用许可证号：SCXK2017-0008。

1.2 主要试剂和仪器

大黄素（南京景竹生物科技有限公司，纯度98%），小鼠甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody, TGAb） 和甲状腺过氧化物酶自身抗体（thyroid peroxidase autoantibody, TPOAb）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）。Bio-Rad酶标仪（美国伯乐公司），流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 动物模型的复制与分组

1.3.1 模型复制取10 mg 猪甲状腺球蛋白溶于5 ml 水，将其与完全弗氏佐剂等体积充分混合制成油包水乳剂。取小鼠甲状腺球蛋白0.5 ml，均匀分布于腹部、背部2 点皮下注射，初次免疫为每个点注射0.25 ml，14 d 后取甲状腺球蛋白与不完全弗氏佐剂等体积混合，再多点皮下注射，持续4 周。

1.3.2 分组60 只小鼠随机分为正常组、模型组和实验组，每组20 只。实验组给予75 mg/kg 大黄素灌胃，1 次/d，持续8 周；对照组和模型组灌胃等剂量生理盐水，1 次/d，持续8 周。

1.4 方法

1.4.1 甲状腺组织形态观察取小鼠甲状腺组织，以生理盐水清洗，在10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，连续切片，行常规HE 染色，在显微镜下观察淋巴细胞浸润情况。

1.4.2 血清TGAb 和TPOAb 水平检测各组小鼠摘眼球取血0.3 ml，静置15 min，2 500 r/min 离心12 min，离心半径15 cm，取上清液，采用ELISA测定TGAb 和TPOAb 水平，严格依据试剂盒说明书进行操作。

1.4.3 甲状腺淋巴细胞浸润程度评价甲状腺淋巴浸润程度=滤泡间浸润程度+上皮间淋巴浸润程度。滤泡间浸润程度评价：（-）为0 分；（±）为1 分；（+）为2 分；（++）为3 分；（+++）为4 分。上皮间浸润程度：0 个炎细胞/张切片为0 分；1 或2 个炎症细胞/张切片为1 分；1 个炎细胞/10 个高倍视野为2 分；1 个炎细胞/5 高倍视野为3 分；1 个炎细胞/2 高倍视野为4 分。

1.4.4 外周血T淋巴细胞亚群检测各组小鼠摘眼球取血0.3 ml，肝素抗凝，制备成1×107个/ml 单细胞悬液，加入抗体，避光染色30 min，加入溶血素反应10 min，2 500 r/min离心6 min，离心半径15 cm，弃上清液，加入PBS 溶液洗涤2 次，加入1%多聚甲醛固定，采用流式细胞术测定T 淋巴细胞亚群变化。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计学软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠甲状腺组织形态变化

正常组小鼠光镜下甲状腺滤泡呈椭圆形或者圆形，滤泡腔内充满淡红色胶质，同时内有适量吸收空泡；甲状腺肉眼观为细条状、淡红色。模型组小鼠光镜下可见甲状腺组织中有弥漫性或灶性淋巴细胞浸润，并伴甲状腺滤泡萎缩；甲状腺滤泡上皮较正常略大，滤泡腔变小；甲状腺肉眼可见颜色变谈，并且与周围组织不粘连。实验组小鼠病变程度较模型组明显减轻。见图1。

图1 各组小鼠甲状腺病理形态学观察 （HE染色×200）

2.2 各组小鼠血清TGAb和TPOAb水平比较

正常组、模型组和实验组小鼠血清TGAb 和TPOAb 水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）。进一步两两比较结果显示：正常组低于实验组和模型组（P ＜0.05）；实验组低于模型组（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠血清TGAb和TPOAb水平比较（n=20，mIU/L，±s）

表1 各组小鼠血清TGAb和TPOAb水平比较（n=20，mIU/L，±s）

注：①与正常组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别TPOAb TGAb正常组模型组实验组F 值P 值1.38±0.25 2.87±0.56①1.83±0.31①②4.983 0.019 108.32±28.39 297.21±38.41①147.54±23.15①②39.479 0.000

2.3 各组小鼠淋巴细胞浸润程度比较

正常组、模型组和实验组小鼠淋巴细胞浸润程度分别为（0.28±0.05） 分、（3.97±0.78） 分和（1.83±0.41）分，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=6.521，P=0.002）。进一步两两比较结果显示：正常组低于实验组和模型组（P ＜0.05）；实验组低于模型组（P ＜0.05）。

2.4 各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群变化

正常组、模型组和实验组小鼠CD3+CD4+和CD3+CD8+比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P ＜0.05）。进一步两两比较结果显示：正常组低于实验组和模型组（P ＜0.05）；实验组低于模型组（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群比较（n=20，%，±s）

表2 各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群比较（n=20，%，±s）

注：①与正常组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别CD3+CD8+CD3+CD4+正常组模型组实验组F 值P 值0.45±0.12 10.37±1.78①3.15±0.79①②16.573 0.000 2.16±0.39 15.87±2.97①8.39±1.86①②28.192 0.000

3 讨论

AT 主要包括特发性粘液性水肿、Hashimoto's甲状腺炎及Grave's 病等，其中Hashimoto's 甲状腺炎即慢性淋巴细胞性甲状腺炎[7-14]。AT 主要是由于机体对甲状腺产生了体液免疫和细胞免疫反应，造成甲状腺功能紊乱[15-20]。目前，临床上针对AT 患者主要采用西医治疗，但其效果并不十分理想，且会导致患者免疫功能下降。近年来，随着中医药的不断深入研究，其应用于AT 患者获得良好疗效，且可增强机体免疫功能[20]。

大黄素属一种蒽醌类衍生物，具有清热解毒功效。药理研究表明，大黄素具有抑制胰酶活性、免疫调节、抗氧化、改善微循环、保护肝肾、抑菌、抗炎及清除自由基等作用。研究报道显示，大黄素主要经调节T 淋巴细胞亚群间的分化、平衡及其分泌能力，进一步发挥免疫保护作用[21]。本研究结果发现，与模型组比较，实验组淋巴细胞浸润程度减轻，由此可见大黄素可减轻甲状腺组织淋巴细胞浸润程度。TGAb 和TPOAb 是AT 的特征性自身抗体，通常AT 患者表现为血清TGAb和TPOAb 水平升高，并且两者在患者血清中表达是临床诊断AT 的重要指标。本研究结果发现，与模型组相比，实验组血清TGAb 和TPOAb 水平降低，由此可见大黄素可降低血清TGAb 和TPOAb水平。

CD4+与CD8+T 细胞是人体免疫系统中重要的免疫细胞，其中CD4+主要表达于辅助T 细胞，并且是Th 细胞TCR 识别抗原的共受体，同时与MHC Ⅱ类分子的非多肽区结合，从而参与Th 细胞TCR 识别抗原的信号转导[22-23]；其中CD8+主要表达于细胞毒性T 细胞上，并且通过表面的MHC Ⅰ类分子与CD4 等其他免疫细胞的MHC Ⅱ类分子结合，识别其他免疫细胞表面结合的抗原物质[24-25]。本研究结果发现，与模型组相比，实验组CD3+、CD4+和CD4+CD8+水平下降，由此可见大黄素可调节免疫平衡。

综上所述，大黄素可下调AT 小鼠血清TGAb和TPOAb，减轻淋巴细胞浸润程度，调节小鼠免疫功能。