Rsf-1在鼻咽癌组织中的表达及与化疗敏感性和预后的关系

孟新宇，刘娟，毕京玉，尚念秀

（山东第一医科大学附属济南市人民医院1.耳鼻喉科，2.皮肤科，山东 济南271199）

鼻咽癌是头颈部最常见的肿瘤之一，我国2013年鼻咽癌发病和死亡比例分别为3.09/100 000和1.57/100 000，成为重要的公共卫生问题[1]。越来越多的研究证实，内科化学药物治疗（以下简称化疗）不再是一种姑息治疗手段，而是鼻咽癌根治性治疗的重要组成部分，同步放化疗、辅助化疗和诱导化疗可提高鼻咽癌的治疗效果[2]。然而化疗药物的耐药严重影响了鼻咽癌预后，因此亟需寻找提高鼻咽癌化疗敏感性的靶点。

Rsf-1 位于11q13.5 染色体上，是人类核心组蛋白及染色质组装相关因子家族一员，与细胞凋亡、细胞周期、衰老和死亡等密切相关[3]。Rsf-1 在肾细胞癌[4]、乳腺癌[5]、前列腺癌[6]等肿瘤组织中高表达，并且与不良生存预后有关；另外，Rsf-1 还与化疗药物的耐药性有关[7]。Rsf-1 在鼻咽癌组织中的表达及意义既往少有报道。本研究采用免疫组织化学法检测鼻咽癌组织中Rsf-1 的表达水平，用ATP 生物荧光抗癌药物敏感性检测技术（ATP based bioluminescence tumor chemoesensitivity assay，ATP-TCA）检测鼻咽癌细胞的体外化疗药物敏感性，探讨Rsf-1 与鼻咽癌临床病理特征、化疗敏感性和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月—2017年8月山东第一医科大学附属济南市人民医院收治的96 例鼻咽癌患者的癌组织标本。其中，男性61 例，女性35 例；年龄21～78 岁，平均（47.98±10.23）岁；国际抗癌联盟头颈肿瘤临床分期为Ⅰ期7 例、Ⅱ期15 例、Ⅲ期53 例、Ⅳ期21 例。此外，选取同期本院40 例鼻咽部慢性炎症组织标本作为对照，其中男性22 例，女性18 例；年龄18～68 岁，平均（47.36±10.32）岁。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

兔抗人RSF-1 单克隆抗体和山羊抗兔IgG 购自武汉菲恩生物科技有限公司，免疫组织化学SP 试剂盒、EDTA 修复液、DAB 显色液购自美国Sigma 公司，ATP-TCA 试剂盒够自北京百奥莱博科技有限公司。氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、环磷酰胺购自北京科展生物科技有限公司），以上化疗药的血浆峰值浓度（peak plasma concentration, PPC）分别为22.5 μg/ml、6.3μg/ml、25.0μg/ml、10.0μg/ml、13.8μg/ml、10.0μg/ml、3.0 μg/ml 和3.0 μg/ml。IX-70 型倒置光学显微镜购自日本Olympus 公司，FLUOstar OPTIMA 多功能荧光发光分析仪购自德国BMG 公司。

1.3 免疫组织化学法及结果判定

组织石蜡标本均由本院病理科完成，切片厚度为4 μm，在70℃下烤片30 min，随后进行脱蜡处理。用EDTA 修复液进行抗原修复，羊血清封闭30 min，加入兔抗人Rsf-1 单克隆抗体（1∶1 000稀释），4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶500 稀释），37℃孵育30 min。随后用辣根标记的链霉素卵白素工作液和DAB 显色液处理，苏木精复染。经过脱水、透明、封片处理后在显微镜下观察。每张切片随机取10 个视野，每个视野计数100 个细胞，根据细胞的染色强度及阳性细胞比例判断Rsf-1 表达水平。

染色强度：染色阴性为0 分，染色为浅黄色为1 分，染色为棕黄色为2 分，染色为棕褐色为3 分。阳性细胞比例：0%～25%计1 分，＞25%～50%计2 分，＞50%～75%计3 分，＞75%～100%计4 分。将2 个得分相乘得出最终结果，0～4 分为低表达；6～12 分为高表达[8]。

1.4 ATP-TCA药敏检测

严格按照ATP-TCA 试剂盒说明书进行操作，取癌组织机械剪碎后加入组织消化酶，制备单细胞悬液，调整细胞浓度至4×104个/孔，接种于96 孔板。将化疗药物（氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、环磷酰胺）进行梯度稀释，设置5 个药物测试浓度，分别为12.5% PPC、25.0% PPC、50.0% PPC、100.0% PPC和200.0% PPC，另外设置不加药阴性对照组（MO）、加入最大ATP 抑制剂组（M1）。在37℃、5%CO2条件下培养5 d，加入50 μl ATP 提取液，混匀后取混合液50 μl 置于微孔板，加入50 μl 发光液。用微板荧光分析仪分析每孔在560 nm 波长处的荧光强度。肿瘤生长抑制率=[1-（test-M1）]/（M0-M1）]×100%，用荧光测定仪自带分析软件计算各测试浓度的肿瘤生长抑制率及各药物的IC50和IC90。参考刘新福等[9]的研究判断药物敏感性，高度敏感：IC50≤25% PPC 及IC90≤100% PPC；中度敏感：IC50≤25% PPC 及IC90＞100% PPC；低度敏感：IC50＞25% PPC 及IC90≤100% PPC；耐药：IC50＞25%PPC 及IC90＞100%PPC。

1.5 随访

术后以电话和门诊方式对鼻咽癌患者进行随访，术后1年内每3 个月随访1 次，随后每6 个月随访1 次。随访时间截至2018年12月。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；不同浓度化疗药物对肿瘤生长抑制率影响的比较用2×2 析因设计方差分析；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验。影响患者预后的因素采用单因素、多因素Cox 回归分析。生存分析用Kaplan-Meier 曲线和Log-rank χ2检验，所有检验为双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rsf-1在鼻咽癌组织中的表达

Rsf-1在鼻咽癌组织中主要表达于细胞质，部分表达于细胞核，呈棕色，在炎症组织中几乎不表达（见图1）。鼻咽癌组织与慢性炎症组织Rsf-1 高表达率分别为66.67%（64/96）和7.50%（3/40），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=39.546，P=0.000），鼻咽癌组织高于慢性炎症组织。

图1 鼻咽癌和慢性炎症组织中Rsf-1的表达 （免疫组织化学法）

2.2 Rsf-1 表达水平与鼻咽癌患者临床病理特征的关系

T3期、T4期患者与T1期、T2期患者的Rsf-1 高表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），T3期、T4期患者高表达率高于T1期、T2期患者。男性与女性，≥50岁与＜50岁，N2期、N3期与N0期、N1期，M1期与M0期，临床分期Ⅰ期、Ⅱ期与Ⅲ期、Ⅳ期患者的Rsf-1高表达率比较，经χ2检验，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各临床病理特征鼻咽癌患者的Rsf-1高表达率比较例（%）

2.3 药敏检测结果分析

不同浓度化疗药物对肿瘤生长的抑制率比较，经2×2 析因设计方差分析，差异有统计学意义（F交互=178.980，P交互=0.000；F浓度=98.704，P浓度=0.000；F药物=9.783，P药物=0.019）。随着药物浓度下降，肿瘤生长抑制率逐渐降低，卡铂在不同浓度下的肿瘤生长抑制率均比其他药物高，而多西他赛和吉西他滨相对较低。见表2。

表2 不同浓度化疗药物对肿瘤生长抑制率的影响 （%，±s）

表2 不同浓度化疗药物对肿瘤生长抑制率的影响 （%，±s）

浓度氟尿嘧啶顺铂卡铂奥沙利铂紫杉醇多西他赛吉西他滨环磷酰胺12.5%PPC 25.0%PPC 50.0%PPC 100.0%PPC 200.0%PPC 26.23±6.45 39.78±8.01 46.65±7.23 54.09±8.90 62.12±10.01 25.09±5.54 41.36±9.09 47.02±7.34 55.90±11.11 63.01±9.78 36.16±11.11 48.59±8.67 54.08±10.72 60.09±9.78 65.09±10.01 21.22±3.43 37.76±5.29 46.38±6.66 52.09±8.76 59.88±12.21 23.82±4.03 36.18±6.13 46.32±9.34 53.00±10.12 59.01±8.78 16.62±4.02 22.37±3.53 35.27±8.03 40.71±7.77 44.56±8.56 15.03±2.09 21.21±4.06 34.72±5.24 41.39±4.18 46.70±10.00 19.28±4.32 29.04±8.01 40.33±5.93 46.01±8.77 50.32±11.12

不同化疗药物的耐药率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=43.091，P=0.001），多西他赛和吉西他滨的耐药率均高于氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、环磷酰胺（P＜0.05）。见表3。

表3 ATP-TCA药敏试验结果 例（%）

2.4 Rsf-1表达水平与化疗药物耐药性的关系

Rsf-1 高表达组与低表达组的紫杉醇耐药率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=5.545，P=0.019），高表达组高于低表达组。其余化疗药耐药率组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 不同Rsf-1表达水平患者的化疗药物耐药性比较例（%）

2.5 鼻咽癌患者预后的影响因素分析

表5 鼻咽癌患者预后的单因素Cox回归分析参数

2.6 Rsf-1表达水平与鼻咽癌患者预后的关系

96 例患者随访时间8～45 个月，中位随访时间24 个月。Rsf-1 高表达组和低表达组的总体生存时间比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.998，P=0.037），高表达组低于低表达组。见图2。

表6 鼻咽癌患者预后的多因素Cox回归分析参数

图2 不同Rsf-1表达水平鼻咽癌患者的生存曲线

3 讨论

鼻咽癌的恶性程度较高，早期容易发生淋巴结转移。化疗在鼻咽癌综合治疗中起到重要作用，而化疗药物耐药是导致治疗失败的主要原因之一，因此寻找早期评价鼻咽癌化疗敏感性和预后的生物学指标具有重要意义。本研究结果显示，Rsf-1与紫杉醇耐药及患者生存预后有关。

Rsf-1 又被称为肝炎BX-抗原相关蛋白，对乙肝病毒复制周期的调控有重要作用[10]。越来越多的研究显示，Rsf-1 与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、分化、细胞周期调控及异常染色体修复等密切相关[5,11]。本研究结果表明，与慢性炎症组织相比，鼻咽癌组织Rsf-1 高表达较高，另外鼻咽癌Rsf-1高表达组患者T3期、T4期占比和Ⅲ期、Ⅳ期占比高于低表达组，提示Rsf-1 可能参与鼻咽癌的发生、发展。

本研究对96 例鼻咽癌组织进行ATP-TCA 药敏检测，结果显示鼻咽癌细胞对8 种化疗药（氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、环磷酰胺） 的耐药率为8.33%～48.96%，其中卡铂的耐药率最低，多西他赛的耐药率最高。紫杉醇是鼻咽癌化疗中最常用的药物，本研究结果表明，Rsf-1 高表达组的紫杉醇耐药率高于低表达组。在宫颈癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的研究中，Rsf-1 高表达也与紫杉醇耐药有关[12-14]。Rsf-1 参与紫杉醇耐药的机制可能与其调控转录因子-κB 信号通路[13]、Ras-丝裂原活化蛋白激酶信号通路[15]有关，另外Rsf-1 与人类蔗糖非发酵蛋白2 同源物形成的蛋白复合物也发挥了耐药作用[14]。

鼻咽癌M 分期、临床分期是鼻咽癌患者生存预后的影响因素，与既往报道结果一致[16-17]。本研究结果表明，Rsf-1 与鼻咽癌患者预后有关；Rsf-1表达水平越高，生存时间越短。既往研究也发现，Rsf-1 高表达与非小细胞肺癌、宫颈癌和肝癌等的不良生存预后有关[18]。Rsf-1 可能会成为鼻咽癌预后的标志物。

本研究的局限性为：①未分析Rsf-1 在鼻咽癌中作用的分子生物学机制；②未检测血清中Rsf-1的表达，Rsf-1 在鼻咽癌早期诊断中的价值需要进一步分析；③本研究对鼻咽癌的耐药性进行了体外研究，未分析本组患者Rsf-1 表达水平与化疗效果及药敏的关系，这是因为本研究未能严格控制治疗方案，未来需要设计临床实验进行研究。

综上所述，Rsf-1 在鼻咽癌组织中高表达，并且与紫杉醇耐药及患者不良生存预后有关。