2018-2019年宁夏皮肤炭疽流行特征及实验室检出情况分析

杨 聪，高建炜，马学平，韩 坤，邹 悦，张术斌，海 娥，陈丽莉

炭疽是由炭疽芽胞杆菌引起的自然疫源性传染病。每年全球约有2万～10万起炭疽病例发生[1-2]，最新研究估算世界约有18.3亿人生活在炭疽风险区内[3]。炭疽根据感染方式不同分为皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽，最常见为皮肤炭疽，约占90%以上。近10年来全国每年报告的炭疽病例均在500例以下，疫情集中在青海、宁夏、内蒙古、甘肃、云南、贵州等畜牧业发达地区[4]。2004-2017年，宁夏皮肤炭疽流行呈现较低水平的散发[5]。而2018年起宁夏报告皮肤炭疽感染病例显著上升，且出现1例死亡病例[6]，为历史罕见。本文将对2018-2019年宁夏皮肤炭疽疫情的流行病学资料及炭疽芽胞杆菌实验室检测情况进行分析讨论，为宁夏皮肤炭疽疫情的预防和控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1描述性流行病学方法 收集宁夏2018-2019年通过网络直报系统上报的炭疽病例信息，并对发病时间、发病地点和人群信息进行流行病学三间分布的分析。

1.2 菌株分离及鉴定

1.2.1试验材料 炭疽杆菌核酸检测(Real-time PCR法)试剂盒购自金瑞鸿捷生物有限公司；核酸提取试剂盒(QIAGEN DNA Mini kit)购自德国QIAGEN公司，血琼脂平皿和普通营养琼脂购自广东环凯微生物有限公司，青霉素纸片购自英国OXOID公司，炭疽芽胞杆菌噬菌体由兰州生物制品研究所提供，ABI7500fast荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2.2样本处理 无菌棉拭子蘸取疑似患者皮肤病灶渗出液，划线接种于营养琼脂培养基和血平皿，涂抹棉签存放于200 μL无菌水的离心管中备用。

1.2.3细菌学检测 按照《炭疽诊断标准》(WS283-2008)的方法进行炭疽细菌分离培养。判定标准为炭疽芽胞杆菌噬菌体裂解试验及青霉素敏感试验阳性可确定分离到炭疽芽胞杆菌。并结合流行病学数据比较采样前后使用抗生素对炭疽芽胞杆菌分离率的影响。

1.3Real-time PCR 试剂盒以炭疽芽胞杆菌毒素质粒PX01上的pagA和PX02上的capB基因，染色体原噬菌体λBa03上的PL3基因为靶基因。按照试剂盒说明书的要求，处理样本并提取核酸后上机检测。反应体系为 20 μL，反应条件为：93 ℃预变性15 s；93 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，此步收集荧光信号，共40个循环。判定标准：首先试剂盒中的阴性对照和阳性对照成立，同时待检样品出现S型扩增且Ct值≤35时可判定结果为阳性。

2 结 果

2.1流行病学分析结果 2018-2019年，自治区炭疽检测实验室共接收到70个疑似皮肤炭疽感染病例的标本，根据《炭疽诊断标准》(WS283-2008)和《宁夏炭疽疫情处置技术方案》，结合疑似病例的流行病学接触史、实验室检测结果及临床症状，最终上报确定45例感染病例，上报病例包括确诊病例12例，临床诊断病例33例。(临床诊断病例是在现有国家标准的基础上结合宁夏工作实际情况，对有流行病学接触史、典型临床表现，皮肤渗出液Real-time PCR检测阳性者，判断为临床诊断病例。)

2.1.1时间分布 2018-2019年上报皮肤炭疽感染病例45例，其中2018年上报27例，2019年上报18例。全年除1月、2月、3月和12月份之外，其它各月均有病例报告，从4月开始呈现逐渐上升的趋势，8月达到高峰期，占病例总数的57.78%，9月开始下降(见图1)，存在明显的季节性。

图1 2018-2019年宁夏皮肤炭疽时间分布情况Fig.1 Monthly incidence of human anthrax in Ningxia from 2018 to 2019

2.1.2地区分布 宁夏共有5个市，22个县区。2018-2019年宁夏皮肤炭疽病例分布在11个县区(占50.00%)，病例数由高至低分别为：西夏区10例、永宁县8例、贺兰县8例、利通区5例、海原县5例、原州区3例、灵武2例、金凤区1例、兴庆区1例、彭阳县1例、同心县1例(见图2)。发病地区涉及养殖业、屠宰、自家饲养等农村及城市边缘等。相比2018年，2019年又新增了原州区、兴庆区、彭阳县3个县区。

图2 2018-2019年宁夏皮肤炭疽地区分布情况Fig.2 Regional distribution of the incidence of anthrax in Ningxia from 2018 to 2019

2.1.3人群分布 全区皮肤炭疽病例报告男性41例，女性4例，男女性别比约为10∶1。年龄最小16岁，最大75岁，30～60岁青壮年有31人，占病例总数的68.89%；职业以农民为主，占病例总数的58%，其次为家畜屠宰者(见图3)。发病患者均因直接或间接接触病死家畜时未采取任何防护措施而被感染。

2.2 细菌学检测结果

2.2.1菌株分离鉴定结果 2018-2019年共收集疑似皮肤炭疽感染标本70份。经培养鉴定，共检出12株炭疽芽胞杆菌，总检出率为17.14%(见表1)。阳性样本的渗出液培养物在血平板中呈现灰白色、扁平、不溶血、干燥且边缘不整齐的粗糙型大菌落，在低倍镜下菌落呈典型的狮鬃样卷发状，经革兰染色后可见呈竹节状排列且两端平齐的革兰阳性大杆菌，有明显的青霉素抑菌圈和噬菌裂解带(见图4)。

图3 2018-2019年宁夏皮肤炭疽人群分布情况Fig.3 Population distribution of the incidence of anthrax in Ningxia from 2018 to 2019

表1 2018-2019年炭疽检测结果Tab.1 Detection rate Bacillus anthracis from 2018 to 2019

图4 炭疽芽胞杆菌鉴定结果 Fig.4 Identification results of B. anthracis

2.2.2采样前后使用抗生素对炭疽芽胞杆菌分离率的影响 在45例感染病例中有14例采样前未使用抗生素类药物，共分离培养到炭疽芽胞杆菌9株，分离率为64.29%；剩余31例感染病例在采样前均口服或静滴过抗生素类药物，仅分离培养到炭疽芽胞杆菌3株，分离率为9.68%，运用Real-time PCR方法的检测阳性率为100%(表2)。

表2 标本采集用药情况与炭疽芽胞杆菌分离情况Tab.2 Antibiotic administration and detection rate of B. anthracis in collected specimens

2.3Real-time PCR检测结果 对疑似皮肤炭疽患者病灶采集的渗出液标本进行Real-time PCR检测，结果显示，阳性标本的渗出液可同时检测出3种基因的荧光信号，3条扩增曲线均呈现典型S型，阴阳性对照成立，且Ct值均小于35。Real-time PCR共检测70份样本，其中阳性45份，检出率64.29%。Real-time PCR检出率明显高于分离培养检出率(表1)。

3 讨 论

炭疽主要流行于我国的农牧地区，是一种常见的人兽共患病。炭疽杆菌是革兰阳性需氧芽胞杆菌, 其芽胞抵抗力极强，可在土壤和动物皮毛等环境中长期存在[7]。人主要通过接触病畜及其产品或食用病畜的肉类而被感染。我国30多个省市发生过炭疽疫情，西北地区为炭疽老疫区[8]。宁夏地处我国西北部，回族人口比重大，饮食以牛羊肉为主。

自2004年开始宁夏一直有人间疫情报告，而2018年报告的皮肤炭疽感染病例接近历年的总病例数，当年宁夏卫生健康委和农牧部门联合对发病县区进行了宣传和疫源地消毒工作，2019年病例数有所下降，但发病数仍超出2017年之前的各年份。2018年虽然进行了严格的防控和疫源地消毒工作，但永宁县和贺兰县仍然有不少病例产生；而相关部门并未对疫源地消毒进行效果评价，疫源地可能存在消毒不彻底风险；2019年新增了原州区、兴庆区和彭阳县3个发病县区，均为2018年发病县区的周边县区；推测原因为炭疽菌有随着雨水迁移的风险。据流行病学调查显示，宁夏皮肤炭疽病例集中在7-9月份，8月份达到峰值；这主要与夏季雨水充沛，且人们部分皮肤暴露多有关。人群分布特点是男性发病多于女性，主要以从事养殖或屠宰的青壮年为主；牲畜的宰杀、放牧以及贩卖等活动大部分都要男性承担，增加了与炭疽病原接触的机会；皮肤炭疽病例分布在11个县区，病例报告的县区均为牛羊养殖，宰杀交易频繁的地区。从流行病学数据上分析宁夏皮肤炭疽流行病学特征和感染途径与其他省情况基本一致[9-11]。

本研究显示，2018-2019年检测的70份样本中共分离得到12株炭疽芽胞杆菌，检出率仅为17.14%。结合流行病学资料发现，对患者在使用抗生素类药物之前采样，检出率明显高于使用抗生素类药物之后采样。这一结果与国内部分学者的研究结果具有一致性[12-14]。分析宁夏炭疽芽胞杆菌分离率较低的原因除了与被采样患者是否使用抗生素类药物有关外，还有以下几个原因：①采集的标本种类单一，应采集与疑似患者病例相关的被宰家畜及土壤样本，以提高炭疽芽胞杆菌检出率；②省级以下疾控实验室检测能力较低。由于宁夏皮肤炭疽样本是各市县区采样送至省级疾控中心进行检测，一定程度上影响了采样时机和检测时间。③可能在患者病灶中存在其它生长速度较快的细菌，且缺少选择性培养基针对炭疽芽胞杆菌增菌，从而导致目标菌分离率较低。

按中国现行炭疽标准规定：实验室确诊病例需分离到炭疽芽胞杆菌或抗体四倍升高[15]，此方法存在耗时长且不易采到恢复期血清的缺点，并不利于疫情控制。近几年分子生物学技术在炭疽检测和鉴定中被充分运用[16-17]。但由于普通PCR技术耗时较长，不利于疫情的快速判定。本研究发现在检测的样本中，Real-time PCR检测阳性率明显高于分离培养阳性率，同时患者服用抗生素后仍然能用此方法检出，因此可在实际工作中将Real-time PCR技术与传统细菌学检测方法相结合，提供完整的实验室诊断证据。此外由于核酸提取方法不统一以及假阳性问题等缺陷，应将Real-time PCR检测结果与临床症状和细菌学培养结果相结合对病例进行判断。

为了能够更好的控制和预防宁夏皮肤炭疽疫情，结合上述流行病学资料和实验室检出情况，建议采取以下防控措施：①每年应在疫情高发期之间，定期向群众宣传教育，特别是发生炭疽疫情的地区及周边养殖区的农牧民，增强群众的安全防范意识；②对皮肤炭疽疫源地开展科学有效的消毒工作，并定期进行消毒效果评价；③建立卫生和农牧部门的联合防控作用机制，确保信息及时互通；④强化省级疾控对基层疾控和医疗机构的指导作用，提高实验室检测人员炭疽病原学检测技术。

利益冲突：无