江西省部分地区鼠形动物中巴尔通体分布及基因组序列研究

杨 梦,王 鹏,袁 辉,刘晓青,周海健，徐晓倩,熊长辉,黄星魁,谢 昀,潘欢弘

巴尔通体病是一种人兽共患病，其病原体是巴尔通体。巴尔通体是一群寄生于哺乳动物红细胞内的革兰阴性、营养要求苛刻、兼性需氧杆菌,可引起猫抓病、战壕热、卡里翁氏病、心内膜炎、视神经炎菌血症等疾病[1]。作为一类新发传染病病原体，巴尔通体的自然宿主包括鼠、兔、猫、犬、蝙蝠、牛、鹿、麋鹿等。为了解江西省鼠类动物中巴尔通体携带情况，本研究于2018-2019年采集鼠形动物肝、脾组织进行巴尔通体分离培养，并对获得的巴尔通体菌株进行全基因组测序和基因多态性分析，为巴尔通体感染的预防控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1样本来源 本研究2018-2019年利用鼠传疾病监测项目采集了130只鼠形动物的肝、脾组织。其中铜鼓县62只、广信区26只、横峰县22只、南城县12只、广丰区8只。

1.2试剂及仪器 胰酶大豆琼脂培养基(TSA)和胰酶大豆肉汤培养基(TSB)购自英国OXOID公司，DNA核酸提取试剂盒购自QIAGEN公司，酶购自大连宝生物工程有限公司；组织研磨器Tissuelyser购自QIAGEN公司，CO2培养箱购自美国NUAIRE公司，PCR扩增仪、成像仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方 法

1.3.1样本采集 用鼠笼或鼠夹捕获鼠形动物，所有的鼠形动物依据外形(体长、体型、毛色、耳长、尾长)、头骨、牙齿的特征进行分类鉴定，然后无菌操作采集肝、脾脏器，置含有1 mL保存液的2.0 mL冻存管中，-80 ℃保存。

1.3.2菌株分离培养和鉴定 每份样本无菌取约25 mg肝或脾组织，加入600 μL TSB后，用组织研磨器研碎，混匀，吸取 0.2 mL组织悬液接种于含 5%脱纤维羊血的TSA平板上，置于36 ℃、5% CO2的培养箱中，培养3 d后，挑取疑似菌落进行鉴定，直至第20 d。

1.3.3属水平特异性基因的PCR检测 挑取适量菌落用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，方法参照说明书步骤。属水平特异性基因PCR扩增目的基因为gltA，引物序列、反应体系和扩增条件参考文献[2]。

1.3.4全基因组测序和序列分析 全基因组测序委托北京博鳌鹰飞生物科技有限公司完成。参照文献的方法进行序列处理和分析、进化树构建[3]。本研究中完成测序的14株巴尔通体基因组序列已提交国家微生物科学数据中心，被接收录入微生物组学数据库，项目编号为NMDC10017684。另外从NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)下载已公布的30株巴尔通体的全基因组序列作为参考序列纳入分析。

2 结 果

2.1携带巴尔通体的鼠形动物构成 本次所捕获的有黑线姬鼠、黄毛鼠、社鼠、褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、臭鼬鼱等鼠形动物。其中野鼠84只，以黑线姬鼠为主，占64.62%；家鼠46只，以褐家鼠为主，占35.38%。广信区、横峰县、铜鼓县以黑线姬鼠为主，南城县均为褐家鼠。从130只鼠类动物的组织样本中分离巴尔通体14株，总携带率为10.77%。黄毛鼠携带率最高(2/6)，其次为黑线姬鼠(8/72)、褐家鼠(3/27)、臭鼬鼱(1/12)(表1)。

表1 江西省鼠形动物中巴尔通体检出率Tab.1 Bartonella infection in myomorphs in Jiangxi Province

2.2巴尔通体分离培养与PCR结果 130份组织样本进行巴尔通体分离培养，检出14株疑似菌株。培养结果：培养3～5 d后可见灰白色，略透明，边缘光滑或粗糙的圆形凸起菌落，革兰染色镜检为阴性小杆菌。PCR结果：14株疑似菌株进行PCR检测，均获得379 bp的扩增条带，判断为gltA基因阳性(图1)。

1、18：DL1000 Marker；2-15：疑似菌株；16：阴性对照(去离子水)；17：阳性对照(阳性参考菌株提取的核酸)。图1 疑似菌株PCR 扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of suspected strains

2.3全基因组分析 将本研究分离的14株巴尔通体进行全基因组测序，将序列和公共数据库已公布的26个不同种的30株巴尔通体全基因组构建聚类树(图2)。总体而言，相同的种在同一分支，本研究分离的14株巴尔通体分布在5个不同的分支，提示分为5种基因型。根据与30株参考菌株全基因组序列的遗传进化关系，可以推测分支2的4株菌为Bartonellatribocorum，其余4个分支的10株巴尔通体没有同26个种的菌株序列聚在一起。分支2包含的4株菌分离自3个县的3种宿主，分支4包含的4株菌分离自2个县的2种宿主，分支5包含的4株菌分离自3个县的1种宿主。

图2 14株本研究分离菌株与30株巴尔通体参考菌株全基因组序列基因多态性分析Fig.2 Analysis of gene polymorphisms of 14 Bartonella isolates obtained in this study and 30 reference strains of Bartonella on the basis of whole genome sequences

3 讨 论

巴尔通体是一类古老又新鲜的人兽共患病病原体，近年来，国内外研究均有从不同宿主分离巴尔通体的文献报道。国外研究报道英国、美国东南部巴尔通体的鼠形动物带菌率较高，分别为 62.20%和 42.20%[4-5]。我国已在福建、黑龙江、内蒙古、浙江、宁夏、广西、海南、山东、广东、上海、云南、河南、青海、山西等省分别在鼠、猫、犬、华南虎、蜱、蚤中分离或检测出巴尔通体病原菌[2,6-13]。

在本次研究中，江西省首次从鼠类动物中分离到巴尔通体病原体，获得江西省鼠形动物巴尔通体的携带率及基因序列，携带率低于广东(19.47%)[14]、浙江(15.20%)[9]、福建(12.34%)[1]，高于广西(2.3%)[11]、海南(9.2%)[12]，填补江西省巴尔通体携带的研究空白。本次捕获的鼠种有黑线姬鼠、黄毛鼠、社鼠、褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、臭鼬鼱，阳性检出以野鼠(黑线姬鼠、黄毛鼠)为主，其次是褐家鼠、臭鼬鼱，提示携带巴尔通体的鼠形动物呈多样性。野鼠主要分布于农田、山坡、丘陵灌木等生存环境，这些生存环境往往是人类生产生活的主要场所，有文献报道野鼠的栖息地往往是巴尔通体的自然疫源地，使得人类感染的几率大大增加，应引起关注[15]。

本次基因组序列研究中，巴尔通体基因型分布在5个不同的分支，即提示有5种不同基因型的巴尔通体，表明江西鼠形动物巴尔通体基因多样性大，种群结构复杂；其中分支2的4株巴尔通体与特利波契巴尔通体(B.tribocorum)聚集成簇，分离自黑线姬鼠、黄毛鼠、褐家鼠3种鼠种，表明宿主动物广泛。国内文献[16]报道这种基因型分布于我国云南、福建、海南、广东、台湾地区，与人类巴尔通体病有关，可引起猫抓病、菌血症、心内膜炎、发热等[17]。其余4个分支的10株巴尔通体没有同26个种的菌株序列聚在一起，提示与参考菌株遗传关系较远。目前已公布全基因组序列的巴尔通体有26个种，还需要测序获得更多种的巴尔通体补充数据库，以建立全面的巴尔通体全基因组数据库，用于种的鉴定。同一分支的巴尔通体分离自不同的地区、不同的宿主，不存在地区或者宿主特异性，提示不同地区、不同宿主间存在菌株的交流和传播。

基于江西省鼠形动物巴尔通体的宿主、基因型的多样性以及鼠形动物宿主携带与致病相关的基因型，作为潜在病原体导致人类感染巴尔通体疾病的风险加大。同时随着生态环境的不断改变，快捷的交通，人类的频繁活动，鼠形动物通过与其他动物及人类的密切接触可能把携带的巴尔通体传播给其他宿主，并造成人类巴尔通体病的隐性感染，因此，为应对不断增长的巴尔通体引起感染的疾病的流行，应加强了解巴尔通体的流行特征、致病性、遗传多样性，加强鼠形动物间巴尔通体的调查研究，并采取预防措施加以控制。

利益冲突：无