可溶性细胞毒性T细胞相关抗原-4在川崎病中的表达及意义*

许文苑，徐美玉，孙宝兰

（南通大学附属医院儿内科，江苏226001）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种病因不明的急性自限性血管炎，临床表现为发热、皮肤黏膜炎症、颈部淋巴结病变，可累及冠状动脉和其他心血管结构[1]。而冠状动脉病变（coronary arterial lesions，CALs）作为KD最严重的并发症，可导致动脉阻塞、心肌梗死和死亡[2]。有研究提示KD为免疫系统疾病，是由于遗传易感个体暴露于微生物源性免疫刺激物所致，并非典型的传染病[3]。KD好发于婴幼儿，80%患儿小于5岁，提示可能与免疫系统尚未完全成熟有关[4]。迄今为止，仍未发现KD特异性检测指标，其诊断仍依赖于临床表现和鉴别诊断[5]。

近年来研究发现T细胞异常激活在KD发病机制中具有重要作用[6]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）作为T细胞表面一种共刺激受体，在激活T细胞中起负性调节作用[7]，其可溶性形态即可溶性细胞毒性T细胞相关抗原-4（soluble cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，sCTLA-4）蛋白水平在某些自身免疫性疾病，如自身免疫性甲状腺疾病、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、系统性红斑狼疮和重症肌无力等患者血清中显著增高，并与疾病严重程度密切关联[8]。本研究选取2019年1月—2019年12月我科诊治的40例KD患儿，探讨血浆sCTLA-4表达水平及其与KD病情、冠状动脉损害的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料符合KD诊断标准[5]患儿40例，在病程1～10天为疾病急性期（KDA组），中位年龄33.0月（四分位数间距39.8月），男性22例，女性18例，其中22例在病程11～20天作为亚急性期（KDS组），中位年龄45.0月（四分位数间距42.5月），男性11例，女性11例。依据心超检查结果和冠状动脉扩张标准[9]将KDA患儿分为冠状动脉损害组（coronary arterial lesion，CAL组）11例和非冠状动脉损害组（NCAL组）29例。依据治疗效果将KDA组患儿分为IVIG敏感组33例和IVIG不敏感组7例，IVIG不敏感组定义为首次IVIG治疗不敏感后予以追加1次IVIG注射。随机选取我科18例呼吸道感染（上呼吸道感染及肺炎）患儿为发热对照组（F组），中位年龄48.0月（四分位数间距36.5月），男性7例，女性11例，热程3～6天。随机选取我院儿外科择期手术的斜疝、隐睾患儿以及健康体检儿童18例为对照组（C组），中位年龄44.5月（四分位数间距19.0月），男性11例，女性7例。各组患儿性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。以上研究对象均无基础疾病，无各类免疫异常性疾病，最近6个月内未使用糖皮质激素、免疫抑制剂等影响免疫功能的药物。本研究获医院伦理委员会批准，并经患儿监护人签字同意。

1.2 检测方法KDA组患儿在静脉注射免疫球蛋白（IVIG）前采血，KDS组患儿在亚急性期再次采血，F组于入院后治疗前，C组于健康体检时或入院手术前采血。采集外周静脉血2 mL，置入EDTA-K2抗凝真空管，室温下放置10～20 min，离心3500 rpm，5 min，分离血浆于EP管中，置-80℃冰箱待测。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆CTLA-4含量，按照试剂盒（eBioscience公司）说明书操作。

1.3 统计学处理应用SPSS 25.0统计学软件行数据分析。计数资料以频数和率表示，组间比较采用Pearson卡方检验或Fisher确切概率法检验。对计量数据进行正态性、方差齐性检验，年龄、sCTLA-4及实验室检查数据呈非正态分布，以中位数（四分位数间距）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两组独立样本间比较采用Mann-WhitneyU检验，配对样本间比较用配对Wilcoxon检验。采用Spearman等级相关性分析评估指标间相关性，受试者工作特征曲线（ROC曲线）计算曲线下面积（AUC），评价指标对预测KD冠脉损害的诊断效能，计算约登指数，排序得出最大值及其对应的最佳临界值、灵敏度、特异度。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CAL组与NCAL组血常规及C反应蛋白比较KD急性期CAL组与NCAL组外周血炎症指标白细胞计数（WBC）、中性粒细胞比例（N）、淋巴细胞比例（L）、血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）以及血小板计数（PLT）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 CAL组与NCAL组血常规及C反应蛋白比较

2.2 各组血浆sCTLA-4浓度比较KDA组血浆sCTLA-4浓度为6.50（3.44）ng/mL，分别高于KDS组4.44（3.71）ng/mL、F组5.19（2.30）ng/mL及C组2.76（2.13）ng/mL，差异均具有统计学意义（H=34.231，P＜0.05）；KDS组血浆sCTLA-4浓度高于C组（Z=2.040，P＜0.05），但与F组差异无统计学意义（Z=1.305，P＞0.05）。F组血浆sCTLA-4浓度高于C组，差异有统计学意义（Z=3.624，P＜0.01）。

2.3 CAL组与NCAL组血浆sCTLA-4浓度比较CAL组血浆sCTLA-4浓度9.04（3.70）ng/mL，高于NCAL组的5.99（1.75）ng/mL，差异有统计学意义（Z=2.881，P＜0.01）。

2.4 不同IVIG敏感程度患儿血浆sCTLA-4浓度比较KD患儿急性期IVIG敏感组sCTLA-4浓度6.21（3.17）ng/mL，IVIG不敏感组sCTLA-4浓度6.86（4.37）ng/mL，差异无统计学意义（Z=0.445，P＞0.05）。

2.5 血浆sCTLA-4与实验室指标及CAL相关性分析Spearman等级相关性分析显示，血浆sCTLA-4与CAL呈正相关，与WBC、N、L、CRP、ESR、白蛋白（Alb）无明显相关性（P＞0.05）。见表2。

表2 血浆sCTLA-4与实验室指标相关性分析

2.6 血浆sCTLA-4水平对KD冠脉损害的评估效能ROC曲线分析显示，血浆sCTLA-4预测KD冠脉损害的AUC为0.798（95%CI：0.638～0.958，P＜0.05），根据曲线坐标表格计算约登指数，排序得出最大值为0.668，其对应最佳临界值为6.75 ng/mL，灵敏度为0.909，特异度为0.759。见图1。

图1 血浆sCTLA-4水平预测CAL的ROC曲线

3 讨 论

自身免疫性疾病患者的sCTLA-4具有调节免疫激活因子与抑制因子平衡的作用，相关研究发现sCTLA-4在T细胞活化的早期和后期均可能具有重要作用[10]，sCTLA-4可通过阻断CD28与B7间的信号传导，抑制早期T细胞的活化，高水平sCTLA-4还能对抗B7与膜表面表达的CTLA-4结合，因此sCTLA-4在T细胞后期的活化阶段会减少抑制信号水平。本研究发现，血浆sCTLA-4在正常儿童中可检测到低浓度表达，而在发热患儿中有所升高，这体现了机体自身免疫调节状态。与这两组相比，KD患儿急性期血浆sCTLA-4浓度明显升高，这一结果与KD是一种自身免疫性疾病的结论吻合。sCTLA-4可能通过改变T细胞活化状态，引起T淋巴细胞亚群稳态失衡，各种免疫调节因子异常分泌，在一定程度上可以为KD与呼吸道感染发热患儿的鉴别提供依据。

目前KD的治疗主要在发热10天内联合使用高剂量IVIG与阿司匹林来降低冠状动脉病变。IVIG治疗KD可能通过刺激IL-10的分泌，并影响T细胞向调节表型分化[11]。然而本研究未发现IVIG不同疗效KD患儿血浆sCTLA-4浓度有明显差异，说明sCTLA-4水平不能提示患儿对IVIG治疗的敏感性。

本研究进一步发现，CAL患儿血浆sCTLA-4水平高于NCAL患儿，相关性分析发现sCTLA-4水平与冠脉损害具有较强的相关性。ROC曲线分析显示，血浆sCTLA-4预测KD冠脉损害的AUC为0.798，取最佳临界值为6.75 ng/mL时，预测KD冠脉损害的灵敏度为0.909，特异度为0.759，具有较好诊断效能。以往研究报道，CTLA-4（+49）A/G多态性与KD患儿冠状动脉损害显著相关，并与KD女性CAL显著相关[12]。本研究结果以及文献报道，都说明sCTLA-4水平与KD患儿冠脉损害的发生密切关联，CTLA-4可能参与KD患儿冠脉损害的发生。

关于正常人体内sCTLA-4的浓度目前尚无一致报道[13-14]，虽然较多研究发现自身免疫性疾病患者sCTLA-4表达增多，但对sCTLA-4检测尚无国际统一的标准品，因此界限值难免不同。Toussirot等[15]在早前的研究中发现类风湿性关节炎患者sCTLA-4浓度较正常人群升高，但最近研究未发现此改变[16]，这种差异可能是由于收集样本的时间不同导致机体免疫状态动态性改变。