青藤碱抑制胶质瘤细胞SHG-44增殖和侵袭研究*

钟琦，盛豪，郭俊

（1南通大学第四附属医院神经外科，江苏盐城224001；2南通大学医学院）

脑胶质瘤是常见的中枢神经系统恶性肿瘤，约占恶性脑肿瘤81%[1]。脑胶质瘤恶性程度高，预后差，高级别胶质瘤生存时间仅1年左右[2]。胶质瘤的治疗方法主要为手术切除辅以放化疗，近年来出现了基因靶向治疗、免疫治疗等新的治疗方案，但化疗仍是决定患者预后的重要手段[3-4]。用于胶质瘤的化疗药物必须具有透过血脑屏障的能力，常见的化疗药物较难发挥作用[5]。青藤碱（Sinomenine，SIN）是从防己科植物青风藤及毛青藤根茎中提取的生物碱单体，在肺癌、胃癌、肝癌等肿瘤中具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用[6-8]。本研究探讨青藤碱对胶质瘤细胞SHG-44增殖和侵袭的影响，希望能为胶质瘤的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料人脑胶质瘤细胞SHG-44（中国科学院细胞库/干细胞库），青藤碱（Sigma-Aldrich），DMEM高糖培养基（Gibco），胎牛血清（Wisent），胰蛋白酶（Bio-Froxx），CCK-8试剂盒（Med Chem Express），Transwell小室（Corning），P-ERK抗体、P-JNK抗体和P-STAT3抗体（Cell Signaling Technology），羊抗兔IgG（Biosharp）。

1.2 实验方法

1.2.1 SHG-44细胞培养：细胞从液氮中复苏后传代。取对数生长期并长满皿底的细胞，PBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶消化，然后以含10%胎牛血清的DMEM终止消化。离心后按1∶3进行传代，使用含10%胎牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，培养约2天可传下一代。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖：取对数生长期细胞，制成细胞悬液，以5×104个/mL接种于96孔板，每组设置5个复孔。培养24 h后更换含不同浓度（0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L）青藤碱的完全培养基，分别于12 h，24 h和36 h进行吸光度检测。弃去旧培养基，每孔加入100μL含10%CCK-8的DMEM，37℃培养箱内孵育1 h，使用酶标仪检测450 nm波长的吸光度，计算细胞增殖。

1.2.3 Transwell细胞侵袭实验：在Transwell小室底层铺上基质胶，37℃下30min使之凝固。制备5×105个/mL细胞悬液，实验组青藤碱浓度为0.5 mmol/L。Transwell小室中各加入100μL对照组细胞悬液和实验组细胞悬液，每组3个复孔，小室下层加入600μL含10%胎牛血清的DMEM。Transwell小室放入下层24孔板内，底层培养基没过Transwell小室的底面和基质胶。在37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，弃去上下层培养基，棉签擦去Transwell小室的培养基、基质胶和残余细胞，小室洗涤后，用0.1%结晶紫染色，400倍显微镜下拍照。

1.2.4 Western blot检测：用含β-巯基乙醇的loading buffer裂解细胞，提取总蛋白。电泳后用考马斯亮蓝染色调齐内参，再次电泳、转膜，将PVDF膜用脱脂牛奶封闭2 h，一抗（1∶2 000）4℃孵育过夜，二抗（1∶10 000）孵育50 min，加发光液在成像系统下拍照。

1.3 统计学处理应用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以±s表示，两组间比较应用t检验，多组间比较应用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 青藤碱抑制SHG-44细胞增殖观察不同浓度青藤碱、作用不同时间对SHG-44细胞增殖的影响，CCK-8检测显示，与对照组（0 mmol/L）相比，0.25 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L、2 mmol/L浓度的青藤碱均显著抑制胶质瘤细胞的增殖，差异均有统计学意义（P＜0.05），且1 mmol/L已达到最大抑制效应。作用12 h、24 h、36 h都能有效抑制SHG-44细胞的增殖，随着作用时间的延长，抑制效果愈明显。提示青藤碱抑制胶质瘤细胞SHG-44的增殖呈时间-剂量依赖关系。见图1。

图1 CCK-8检测SHG-44细胞增殖能力

2.2 青藤碱抑制SHG-44细胞的侵袭细胞增殖实验显示，1 mmol/L青藤碱已达到最大抑制效应，为了防止高浓度青藤碱对细胞数量的影响，采用0.5 mmol/L浓度的青藤碱进行侵袭实验。Transwell侵袭实验发现，青藤碱组与对照组相比，SHG-44侵袭能力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 青藤碱对SHG-44细胞P-JNK、P-ERK及PSTAT3表达的影响Western blot实验发现，与对照组比较，青藤碱显著上调SHG-44细胞内P-JNK、PERK蛋白的表达，下调P-STAT3蛋白的表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图2 Transwell实验检测SHG-44细胞侵袭能力

图3 Western blot检测P-JNK、P-ERK和P-STAT3蛋白表达水平

3 讨 论

胶质瘤起源于星形胶质细胞、神经干细胞和少突胶质前体细胞等[9]，目前主要的治疗方法是手术切除，高级别胶质瘤术后辅以放化疗[10]。治疗后胶质瘤的复发率较高，可能与手术切除后肿瘤残留以及对放化疗不敏感有关。胶质瘤常用的化疗药物有替莫唑胺、洛莫司汀、甲基苄肼、长春新碱等[11]，近些年中药在肿瘤中的运用受到人们关注，许多中药提取物已用于临床，如紫杉醇已成为乳腺癌、卵巢癌等肿瘤的一线用药[12]。青藤碱对肿瘤也有一定的作用，在肺癌、胃癌等肿瘤中已有报道，具有促凋亡、抑制细胞增殖、侵袭以及转移等作用[6-7]。研究发现，青藤碱可下调mmp-2、mmp-9来抑制胶质瘤细胞U251的迁移和侵袭[13]。本研究发现，青藤碱可显著抑制胶质瘤细胞SHG-44的增殖和侵袭，并呈剂量-时间依赖性。为进一步探究青藤碱的作用机制，我们对相关信号通路的关键节点进行了筛选。实验发现青藤碱可下调SHG-44细胞中STAT3磷酸化水平，STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）是一种胞质信号分子，也是胞核转录因子，参与细胞的增殖、转化及迁移等过程[14]。STAT3过表达及磷酸化水平与肿瘤进展、患者不良生存预后密切相关[15]。在正常情况下，由于激活STAT的蛋白抑制剂（protein inhibitor of activated STAT，PIAS）、细胞因子信号抑制剂（suppressors of cytokine signaling，SOCS）以及几种蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）固有的抑制作用，STAT3信号转导较低。一旦被上游信号激活，STAT3蛋白Tyr705处的酪氨酸残基就会磷酸化，导致STAT3发生核转位，随后STAT3下游靶基因开始转录。STAT3作为一种癌基因，是许多由细胞因子、生长因子或肿瘤蛋白触发的信号通路的汇合点[16]。青藤碱可能通过抑制STAT3磷酸化，从而抑制胶质瘤细胞SHG-44的增殖和侵袭。本研究发现，青藤碱也可上调磷酸化JNK、磷酸化ERK。c-Jun N末端激酶（JNK）是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的亚家族，调节重要的细胞活动，包括细胞增殖，分化和凋亡[17]。所有MAPK都需要对其激活环进行磷酸化才能发挥全部催化活性。完整的JNK活性需要JNK激活环TPY基序内的Thr和Tyr双重磷酸化，去除任何一种磷酸盐都会降低JNK对所有底物的活性[18]。ERK作为有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径（通常称为RAS-RAF-MEKERK信号级联）的重要环节，起着很重要的调节作用。MAPK途径的功能是将上游信号传递至其下游效应分子，以调节生理过程，例如细胞增殖，分化，存活和死亡[19]。ERK1/2位于未刺激细胞的细胞质中，一旦激活，ERK1/2就转移到细胞核，并通过磷酸化调节各种转录因子的活性，最终调节细胞的代谢和功能，并影响细胞特定生物学效应[20]。青藤碱上调PJNK、P-ERK的表达，可能是通过JNK途径或者MAPK途径抑制胶质瘤的增殖和侵袭。

综上所述，青藤碱明显抑制胶质瘤细胞SHG-44增殖和侵袭，可能与调控P-JNK、P-ERK和PSTAT3表达水平有关。P-JNK、P-ERK和P-STAT3三者可能存在相互联系或上下游关系，在后续研究中进一步验证，并采用体内实验更全面、深入研究青藤碱对于胶质瘤的作用。