Klotho蛋白通过抑制β-catenin减轻高糖诱导的足细胞损伤*

祁月，张叶，郭乃凤，张光第，戴厚永

（南通大学附属医院肾内科，江苏226001）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一。在西方国家DN是终末期肾衰竭（ESRD）的首要病因，在我国糖尿病相关慢性肾脏病患者逐年增多，2016年已达2 430万人，预计未来几年DN也将是我国ESRD的首要病因[1]。DN严重影响患者预后，积极研究DN发病机制对防治DN具有重要意义。DN发病机制复杂，仍未完全阐明，目前认为足细胞损伤在DN发病中发挥关键作用，是研究的重点内容[2-3]。

Klotho是一种与衰老有关的蛋白，目前发现Klotho蛋白有α、β和γ三种类型，常说的Klotho蛋白即指α型。除抗衰老作用外，Klotho蛋白还有抑制胰岛素/类胰岛素生长因子1（IGF-1）信号传导途径和Wnt信号，调节钙和磷稳态，调节甲状旁腺激素（PTH）分泌，抗氧化应激，抑制细胞炎症和凋亡，促进自噬，抑制纤维化等作用[4]。研究发现肾脏不仅是全身Klotho的主要来源，而且是清除循环中Klotho的主要器官[5-6]。Klotho主要表达于远曲小管[5]，近年来发现在足细胞也有Klotho表达[7]。研究发现，外源性Klotho通过抑制足细胞TRPC6通道Ca2+内流而减轻蛋白尿，有关Klotho对足细胞的保护作用逐渐引起学者们的重视[7]。既往我们研究发现抑制足细胞β-catenin能减轻高糖诱导的足细胞上皮间质转分化[8]，本实验拟探讨Klotho是否能通过抑制足细胞β-catenin表达而减轻足细胞损伤，为临床防治DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 足细胞培养及干预从液氮罐中取出冻存的小鼠永生系足细胞（美国Mundel教授惠赠），复苏后加入新鲜培养液吹散细胞，接种至涂有Ⅰ型胶原的25 cm2培养瓶，用含10%胎牛血清（美国Gibco）的RPMI 1640培养基，添加小鼠重组γ-IFN 10 U/mL（美国PeproTech），在33℃许可条件下培养，隔天换液。当细胞长至85%左右融合时，予以0.25%胰蛋白酶消化传代。诱导分化时，将未分化足细胞置于37℃非许可条件下（不含γ-IFN）继续培养10天至分化成熟，然后无血清继续培养24 h，使细胞同步化。然后分为正常对照组（含5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（含30 mmol/L葡萄糖）、渗透压对照组（含5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇）及干预组（Klotho 100 pmol/L+30 mmol/L葡萄糖），继续培养48 h。

1.2 RNA提取及基因检测应用RNAiso plus试剂（宝生物工程大连有限公司），按说明书操作提取足细胞总RNA，后者采用SYBR ExScript TM RT-PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司）进行反转录合成cDNA。取2μL cDNA产物，加相应引物及SYBR预混液等组成20μL体系，在ABI PRISM 7300 PCR仪（美国Applied Biosystems）进行扩增。目的基因引物desmin：上游5’-TGCAGCCACTCTAGCTCGTA-3’，下游5’-GACATGTCCATCTCCACCTG-3’。β-catenin：上游5’-GCAGCAACAGTCTTACCT-3’，下游5’-ACAGGACTTGGGAGGTAT-3’。β-actin：上游5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游5’-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3’。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的含量，以β-actin作为内参。

1.3 蛋白提取及Western Blot法检测将足细胞用PBS洗涤2遍，加适量裂解液后用细胞刮收集细胞，离心，取上清液检测蛋白浓度。取20μg蛋白，SDSPAGE凝胶电泳分离，湿法转入PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，0.3%TBST洗膜3次，分别加入相应一抗（desmin和β-catenin均为1∶200稀释，美国Santa Cruz），4℃过夜。TBST洗膜，分别加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，PBS洗膜3次，ECL化学发光法曝光。以目的蛋白与βactin蛋白的灰度比值进行半定量分析。

1.4 统计学处理采用SPSS 22.0统计学软件行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高糖诱导足细胞损伤与正常对照组相比，高糖组足细胞损伤标志物desmin基因和蛋白表达均上调，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明高糖诱导足细胞损伤，而渗透压对照组与正常对照组的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 高糖对足细胞desmin表达的影响

2.2 高糖诱导足细胞β-catenin表达上调与正常对照组相比，高糖培养足细胞48 h后，β-catenin基因和蛋白表达水平明显上调，差异均有统计学意义（P＜0.05），而渗透压对照组β-catenin水平与正常对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

2.3 Klotho减轻高糖诱导的足细胞损伤正常糖培养条件下，足细胞desmin表达很少，高糖刺激足细胞损伤后，desmin基因和蛋白表达明显增强，差异均有统计学意义（P＜0.05），予Klotho干预后，高糖诱导的desmin基因和蛋白过表达明显受抑制，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图2 高糖对足细胞β-catenin表达的影响

图3 Klotho对高糖诱导的足细胞损伤的影响

2.4 Klotho抑制高糖诱导的足细胞β-catenin表达上调与正常对照组相比，高糖刺激导致足细胞损伤后，β-catenin基因和蛋白表达明显增强，差异均有统计学意义（P＜0.05），予Klotho干预后，能抑制高糖诱导的β-catenin基因和蛋白过表达，差异均有统计学意义（P＜0.05），从而减轻足细胞损伤。见图4。

图4 Klotho对高糖诱导的足细胞β-catenin表达的影响

3 讨 论

足细胞损伤在DN发病机制中起关键作用[2-3]。糖尿病时，各种损伤因子导致足细胞肥大、自噬、凋亡、细胞脱落以及上皮间充质转化等多种病理改变[9]。目前desmin是公认的足细胞损伤重要生物标志物[10]。本实验发现，高糖能诱导足细胞损伤，表现为desmin基因和蛋白水平均上调，同时β-catenin表达也上调。Klotho能抑制β-catenin表达上调，减轻足细胞损伤，使desmin表达下调。

国内台湾学者发现链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠肾组织Klotho表达减少[11]，敲除Klotho基因可加剧糖尿病小鼠早期肾脏病变[12]，相反，Klotho过表达通过减轻氧化应激而减少糖尿病小鼠蛋白尿[13]。在早期DN患者肾组织也发现Klotho表达减少[14]。此外，DN患者血Klotho水平低于正常人，且Klotho水平与肾小球滤过率成正相关，与尿白蛋白肌酐比成负相关[15]，以上研究均表明Klotho与DN关系密切。实验证明，补充外源性或增加内源性Klotho生成能延缓慢性肾脏病进展[16]。

LIU等[17]发现Klotho是Wnt信号内源性抑制剂。随后ZHOU等[18]发现Klotho可通过抑制Wnt信号下游的β-catenin而改善肾脏纤维。本实验发现Klotho在减轻足细胞损伤的同时，抑制β-catenin表达。结合既往研究，我们认为足细胞可能存在Klotho/β-catenin信号途径，糖尿病时足细胞Klotho表达减少，导致β-catenin激活，外源性Klotho通过抑制β-catenin活化而减轻足细胞损伤。有关糖尿病时Klotho减轻足细胞损伤的作用机制尚需体内实验进一步验证。