自体富血小板血浆纳米球凝胶缓释系统对兔膝关节软骨损伤的修复效果研究*

缪小兵，周友浪，居飞，谭军

（1如皋市人民医院骨科，江苏226500；2南通大学附属医院手外科）

由于运动损伤或慢性疾病，关节软骨损伤越来越常见，软骨损伤后不易修复。自体富血小板血浆中血小板激活后释放大量生长因子，有些生长因子具有促进软骨细胞增殖及基质合成的作用，但活性持续时间不长。纳米球可吸附、包裹或溶解药物，便于药物缓慢释放和靶向给药。乳酸-羟基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）具有良好的生物相容性、安全性、稳定性，常用于制备纳米球。透明质酸是关节滑液和软骨基质的成份，透明质酸水凝胶是以透明质酸为支架，通过化学交联方法制备的凝胶，具有安全性，稳定性和可吸收性，对加入其中的物质有很好的缓释作用。本实验通过建立自体富血小板血浆纳米球凝胶缓释系统，观察其对兔膝关节软骨损伤的治疗效果，为临床上软骨损伤的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物新西兰兔27只，月龄4～5个月，体重2.2～3.1 kg，平均2.5±0.5 kg。随机分成空白组、凝胶组和纳米球凝胶组各9只。实验兔购自邳州市东方养殖有限公司［许可证号SCXK（苏）2017-0002］，由南通大学实验动物中心饲养，实验地点在南通大学附属医院手外科实验室［实验许可证号：SYXK（苏）2017-0045］。

1.2 主要实验器材及试剂低速离心机（AXTD5A，安信实验仪器有限公司）；血细胞全自动分析仪器（X-2100，日本希森美康）；超声波匀浆器（Ultra Turrax，IKA，德国）；欧林巴氏显微镜（BX-51）；苏木素伊红染液（如吉生物科技有限公司）；番红固绿染液（福州飞净生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 富血小板血浆的制备：兔心脏采血7 mL，将2 mL注入EDTA-K2抗凝的真空采血管中，进行血小板计数。将装有5 mL兔动脉血的抗凝真空采血管进行离心，2 000 r/min，10 min。采血管中血液分为三层：上层血清层、下层红细胞层以及介于二者之间的白膜层（内含血小板、白细胞等）。吸取全部上清至交界面下3 mm，移至另一支真空采血管离心，2 000 r/min，10 min，标本依然分为血清层、白膜层及红细胞层，用注射器吸取血清层上方3/4部分并弃去，剩余部分即为富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）的制备。5 mL兔动脉血可制备约0.5 mL PRP，进行血小板计数。

1.3.2 PRP透明质酸水凝胶制备：将200 mg透明质酸粉末溶解于15 mL 2-（N-吗啉）乙磺酸-水合物（MES）溶液中，加入287 mg N-羟基琥珀酸亚胺（NHS），再加入94.2 mg炔丙基胺，透析2 h，冻干形成海绵状固体。取出海绵状固体30 mg溶解于2.4 mL双蒸水，叠氮-聚乙二醇-叠氮（Azide-PEG-Azide）30 mg溶解于30μL二甲基亚砜（DMSO）。将以上两种溶液混合，加入硫酸铜溶液10μL，混合均匀，再加入抗坏血酸溶液10μL，混合均匀制备成透明质酸水凝胶。将0.5 mL PRP加入透明质酸水凝胶中，摇匀，制备成PRP透明质酸水凝胶。

1.3.3 纳米球凝胶缓释系统制备：首先采用复乳法制备载PRP纳米微球，将PRP 500μL加到2 mL含20 mg PLGA的二氯甲烷中，使用高速匀浆机乳化，3 000 r/min，2 min。将混合物注入到4.5 mL 1.5%聚乙烯醇溶液中，继续匀浆乳化，6 000 r/min，5 min，形成复乳液。然后在室温下搅拌至少3 h，去除二氯甲烷。收集纳米微球，蒸馏水洗涤（10 000 r/min，5 min，4℃），然后将纳米微球分散到双蒸水中。使用Zeta sizer Nano（PSS Nicomp，Santa Barbara，CA，USA）通过DLS法测量粒径，计算平均粒径。扫描电镜评估颗微球形状和表面形貌。纳米球凝胶缓释系统制备：将PRP先加入纳米球中，然后再加入透明质酸水凝胶中，制备成PRP纳米球凝胶缓释系统。

1.3.4 软骨缺损区造模：拔去覆盖在静脉表面皮肤上的兔毛，酒精棉球消毒。从兔耳缘静脉注入1 mL/kg剂量的3%戊巴比妥钠，待角膜反射消失后将兔取仰卧位，固定四肢。双膝部术区备皮，碘伏棉球消毒，利多卡因局部麻醉。取膝前正中纵切口约4.0 cm，从膝内侧入路切开，向外推开髌骨，进入关节腔。屈曲膝关节，用克氏针在股骨内侧髁软骨面钻孔，制造软骨缺损面模型，大小2 mm×3 mm，厚度1 mm。空白组冲洗后髌骨复位后逐层缝合。凝胶组将预先制备的PRP凝胶0.25 mL用无菌刀片切成2 mm×3 mm×1 mm小块，嵌入软骨缺损面，将多余的凝胶涂抹覆盖在软骨缺损区表面，髌骨复位后逐层缝合。纳米球凝胶组将预先制备的纳米球凝胶0.25 mL用无菌刀片切成2 mm×3 mm×1 mm小块，嵌入软骨缺损面，将多余的纳米球凝胶涂抹覆盖在软骨缺损区表面，髌骨复位后逐层缝合。所有实验动物均未予制动，未注射抗生素。

1.3.5 实验动物取材及处理：各组实验动物于术后4周、8周、12周从耳缘静脉推入10 mL空气分别处死3只，从原来手术区切开，切断韧带，从膝上2 cm处切断股骨，取出股骨髁标本。先对软骨面进行大体观察并拍照，根据国际软骨修复协会（ICRS）软骨修复宏观评分表进行评价。将标本置入10%福尔马林溶液浸泡备用。

1.3.6 组织脱钙、切片，染色：将兔膝关节实验区关节面切成5 mm×5 mm×5 mm小块，放入脱钙液中脱钙24 h。制成蜡块，4μm切片，每个蜡块切4张切片，脱蜡至水。2张切片采用HE染色，2张采用番红-固绿染色，最后二甲苯透明，光学树脂封固。根据O′Driscoll组织学评分表进行评价。

1.4 统计学处理应用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。多组间比较采用随机区组设计的方差分析，两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PRP血小板计数兔全血血小板计数（320.00±62.71）×109/L，富血小板血浆中血小板计数（1 363.50±157.69）×109/L，约为全血4倍。

2.2 大体观察及ICRS宏观修复评分术后4周时空白组软骨缺损边缘与正常软骨边界清楚，软骨缺损区域底部有少许淡白色组织覆盖，不及软骨缺损厚度的1/3。凝胶组软骨缺损边缘与正常软骨边界清楚，软骨缺损区域有白色组织覆盖，与周围正常软骨颜色、厚度相当，但表面不光滑。纳米球凝胶组软骨缺损边缘与正常软骨边界清楚，软骨缺损区域有白色类似软骨组织覆盖，相当于软骨缺损厚度的3/4。8周时空白组软骨缺损边缘与正常软骨边界清楚，软骨缺损区域有淡红色组织覆盖，不及软骨缺损厚度的2/3。凝胶组、纳米球凝胶组软骨缺损边缘与正常软骨边界不清，软骨缺损区域有白色组织覆盖，与周围正常软骨、颜色厚度相当，表面光滑。12周时空白组软骨缺损边缘与正常软骨边界清楚，软骨缺损区域有淡红色组织覆盖，表面不光滑。凝胶组软骨缺损边缘与正常软骨边界不清，软骨缺损区域有白色组织覆盖，与周围正常软骨颜色、厚度相当，表面光滑。纳米球凝胶组软骨缺损边缘与正常软骨边界分辨不清，软骨缺损区域有白色类似软骨组织覆盖，与周围正常软骨厚度相当，表面光滑。

软骨缺损区ICRS宏观修复评分凝胶组、纳米球凝胶组在4周、8周、12周时均高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；凝胶组、纳米球凝胶组8周、12周ICRS宏观修复评分高于4周，差异均有统计学意义（P＜0.05）；但凝胶组与纳米球凝胶组各时间点比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 组织学观察及O′Driscoll组织学评分HE染色显示，4周时空白组缺损区域底部有少量细胞聚集，成纤维细胞为主，表面无软骨基质覆盖，缺损区域与正常软骨边界清楚。凝胶组软骨缺损区域有大量细胞聚集，系成纤维细胞或透明细胞，表面有类似软骨基质组织覆盖，厚度达到正常软骨厚度1/2。纳米球凝胶组软骨缺损区域有大量细胞聚集，表面有类似软骨基质组织覆盖，厚度达到正常软骨厚度3/4，但细胞排列与正常软骨不一致。番红固绿染色显示空白组软骨缺损区无软骨基质覆盖，无软骨细胞，与正常软骨界限清楚。凝胶组和纳米球凝胶组可见少许软骨细胞。

表1 ICRS软骨修复宏观评分分

8周时空白组缺损区域底部有少量细胞排列，表面无软骨基质覆盖，缺损区域与正常软骨边界清楚。凝胶组软骨缺损区域与正常软骨厚度一样，有大量软骨细胞排列，呈簇性、团块状，但细胞排列与正常软骨不一致。纳米球凝胶组软骨缺损区域有大量细胞聚集，表面有类似软骨基质组织覆盖，厚度与正常软骨一样，但软骨区域细胞排列与正常软骨不一致。番红固绿染色显示空白组未见软骨细胞。凝胶组见大量软骨细胞，软骨基质厚度不及正常软骨。纳米球凝胶组可见大量软骨细胞，软骨基质厚度与正常软骨相当。

12周时空白组缺损区域底部无细胞聚集，表面无软骨基质覆盖，缺损区域与正常软骨边界清楚。凝胶组软骨缺损区域与正常软骨厚度一样，缺损区域有少量软骨，但细胞数量不及正常软骨，排列与正常软骨不一致。纳米球凝胶组软骨缺损区覆盖组织达到正常软骨厚度，增生的组织有软骨细胞，但数量不及正常软骨，排列与正常软骨不一致。番红固绿染色显示空白组未见软骨细胞及软骨基质。凝胶组见软骨细胞及基质，较8周时软骨细胞减少，软骨基质变薄。纳米球凝胶组可见软骨细胞及基质，较8周时软骨细胞减少，软骨基质变薄，较边缘正常软骨厚度低。见图1、2、3。

图1 HE染色切片观察(4×)

图2 番红固绿染色切片观察(40×)

图3 PRP凝胶及纳米球缓释系统图

O′Driscoll组织学评分凝胶组、纳米球凝胶组在4周、8周、12周时均高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05），纳米球凝胶组评分最高。见表2。

表2 O′Driscoll组织学评分分

3 讨 论

关节软骨损伤发生率国外报道为5%，特定人群如运动员可高达22%～50%[1]。关节软骨为无血管组织，自我更新能力低，软骨细胞为终末分化细胞，关节负重区的透明软骨在外伤或病理性损伤后，软骨再生修复能力极其有限，很少能够自愈[2-4]。

WHITMAN等[5]于1997年首先将富血小板凝胶局部用于创伤治疗，之后PRP凝胶逐渐成为组织工程领域尤其是骨创伤缺损修复方面的研究热点，并在临床中得到一定应用。自体PRP中血小板浓度达到全血3～5倍，可以发挥最佳效果[6]。本实验制备的PRP中血小板浓度达到全血的4倍，可满足实验要求。PRP激活后，可以释放大量生长因子，其中有些生长因子具有促进软骨细胞增殖及基质合成的作用。但MARX[7]研究提示血小板激活后，95%生长因子会在1小时内释放。生长因子半衰期有限，无法达到长期效果。MISHRA等[8]研究显示未激活的PRP在机体内发挥的作用更为有效，在体内缓慢激活的过程可持续释放生长因子。本实验制备的PRP中未加入葡萄糖酸钙及牛凝血酶等激活剂。

为了达到生长因子缓慢释放目的，将PRP结合不同支架或缓释载体的研究越来越多。LIU等[9]发明一种PRP透明质酸水凝胶复合物（HNPRP水凝胶），可以实现生长因子的缓慢线性释放，14天后血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TFG-β）的释放也无下降趋势。SUN等[10]发现在自体PRP加入PLGA支架，可以促进兔膝关节全层软骨缺损的修复。SHI等[11]将Kartogenin（KGN）加入PLGA纳米球中，再加入透明质酸水凝胶形成缓释系统，可以持久缓慢释放KGN，能促进兔膝关节软骨修复。ZHOU等、YANG等[12-13]研究提示透明质酸水凝胶和PLGA纳米球对加入其中的生长因子具有很好的缓释作用，无细胞毒性，生物安全性好，缓释作用超过1个月。

本实验选择透明质酸水凝胶及PLGA纳米球凝胶作为自体PRP缓释载体。透明质酸在关节腔内起润滑作用，可以覆盖及保护软骨表面，抑制软骨变性，绝大部分在体内代谢成二氧化碳，极少量代谢产物从尿排出，无毒副作用及排斥反应。将PRP加入透明质酸水凝胶中可以达到生长因子缓慢释放的目的，同时不会产生排斥反应。PLGA是由乳酸与羟基乙酸随机聚合而成的可降解的生物高分子材料，本实验制备纳米球的PLGA（PGA∶PLG，75∶25）体内完全降解时间为4～5个月，能满足实验12周的需要，其代谢产物为二氧化碳和水。通过扫描电镜观察，制备的纳米球形态良好，分散均匀，无凝集。扫描电镜下，载PRP纳米球凝胶缓释系统具有三维立体结构，载PRP纳米球弥散分布在凝胶中。

本实验大体观察显示，空白组12周观察时软骨缺损区仍明显，而凝胶组和纳米球凝胶组软骨缺损区不明显，形成的白色组织与正常软骨组织界限不清，表面光滑。ICRS宏观修复评分凝胶组、纳米球凝胶组在4周、8周、12周时均高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；凝胶组、纳米球凝胶组8周、12周ICRS宏观修复评分高于4周，差异均有统计学意义（P＜0.05）。HE染色和番红固绿染色切片观察显示，凝胶组、纳米球凝胶组在4周、8周、12周时的修复效果优于空白组，纳米球凝胶组的作用又要优于凝胶组。O’Driscoll组织学评分凝胶组、纳米球凝胶组在4周、8周、12周时均高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05），纳米球凝胶组评分最高。提示富血小板血浆凝胶及纳米球凝胶缓释系统对软骨修复都有明显的促进作用。但无论凝胶组还是纳米球凝胶组，8周时对软骨的修复作用都要优于12周，12周时HE染色、番红固绿染色切片显示修复的软骨有一定程度的退变。同时，软骨缺损区修复后形成的组织中软骨细胞的排列以及基质成分与正常软骨结构还是有差别。下一步我们拟通过增加凝胶组及纳米球凝胶组中PRP的含量，观察对兔软骨修复的效果。