阿魏酸通过胰岛素/IGF信号通路和DAF-16促进秀丽隐杆线虫寿命和应激抵抗力

况琪斐，陈巧超，张 玲，何 文，裴 中

（1.中山大学附属第一医院老年医学科，广东广州 510080；2.中山大学附属第一医院神经内科，广东广州 510080）

衰老和疾病是生命科学领域的热门研究领域。衰老的本质是由于被动的随机错误积累（随机老化理论）或主动的非随机过程（程序老化理论）导致身体结构和功能随年龄而发生的退化［1］。许多与年龄有关的疾病，包括癌症、心血管疾病和神经退行性疾病，将变得越来越普遍［2］。如果能够有效地控制衰老的进程，那么疾病的数量将减少，人类的寿命和健康状况将得到有效改善。迄今为止，虽然药物干预在延缓衰老方面已经取得了一定的效果，但目前还没有获得国家药监局批准的抗衰老药物，因此寻找天然有效的抗衰老药物十分重要［3］。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）是研究衰老的经典生物学模型。秀丽隐杆线虫具有寿命短，易于培养，体积小的优点［4］。此外，在秀丽隐杆线虫的基因中已鉴定出近80%的人类基因同源物。最近的研究表明，特定的遗传和环境因素影响线虫的衰老和寿命［5］。特别注意的是，秀丽隐杆线虫与人类具有相似的衰老方面，其中寿命的延长与压力的承受能力有关［6］。因此，秀丽隐杆线虫作为模型生物，在鉴定可能有益于长寿的化合物和机制方面具有很高的价值。阿魏酸（ferulic acid，FA；3-甲氧基-4-羟基肉桂酸）是大麦颗粒、麦麸、大米胚乳、玉米糠等植物细胞壁中常见的多酚类化合物［7］。它通过酯键与多糖共价连接［8］。在植物细胞壁中，脂肪酸可通过阿魏酸酯酶的作用释放出来［9］。阿魏酸具有广泛的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性［10］。阿魏酸在日本被用作食品添加剂的抗氧化剂和食品防腐剂［11］。在中国，治疗者们利用阿魏酸的抗氧化性，使用阿魏酸钠治疗心血管和脑血管疾病［12］。阿魏酸可调控促炎性NF-κB 及其相关的基因信号，从而减弱老年大鼠中氧化应激引起的炎症相关疾病［13］，也可通过激活中央毒蕈碱和烟碱样受体和抗氧化酶，从而减少认知缺陷的进展［14］。然而，其在延长寿命和抗衰老机制方面的研究甚少，本研究以秀丽隐杆线虫为模型，对阿魏酸的延缓衰老机制做进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

阿魏酸（分子式：C10H10O4，分子质量：194.18）购自美国Sigma 公司；大肠杆菌（Escherichia coli）OP50、野生型N2 秀丽隐杆线虫（C.elegans）、突变体线虫daf-2（DR1572）、daf-16（CF1038）由线虫遗传中心（norhabditis Genetics Center，CGC）提供并保存于本实验室；胰蛋白胨、琼脂粉、NaCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、酵母提取物、胆固醇购自上海萨恩科技有限公司；Trizol 试剂、cDNA 反转录试剂盒、SYBRGreen 购自南京建成生物工程研究所。

MyCycler 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、MyiQ2 实时荧光定量PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；智能恒温培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；Neofuge 13R 台式高速冷冻离心机，力康发展有限公司；NewClassic MS 电子天平，上海奕宇电子科技有限公司；SMZ-168 显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；U-RFLT50 型荧光显微镜，日本Olympus 公司。

1.2 秀丽隐杆线虫同步化

固体培养基（nematode growth media，NGM）配制：称4.0 g 琼脂、0.5 g 蛋白胨、0.6 g NaCl 加入195 mL 蒸馏水溶解摇匀。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，温度降至60 ℃左右，加入5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液、1 mol/L MgSO4溶液、1 mol/L CaCl2溶液各200 µL，pH6.0 磷酸氢钾缓冲液5 mL，倒板备用。用M9 缓冲溶液收集生长健康无染的L4 期线虫到EP 管中，反复离心清洗3～5 次，弃上清。每管线虫加入裂解液（0.5 mol/L 氢氧化钠和2.5%次氯酸），裂解8 min，1 000 r/min，离心2 min，离心机半径r=17 cm，弃上清，用M9 反复清洗5 次，加入M9 在20 ℃恒温静置12 h，1 000 r/min，离心1 min，离心机半径r=17 cm，弃上清，转移至含有OP50 大肠杆菌的线虫培养基（nematode growth medium，NGM），20 ℃恒温培养2 d，即得同期化L4 期幼虫。

1.3 寿命测定

首先，使用阿魏酸对大肠杆菌OP50 增殖的影响评估毒性试验，以确定所有实验均在无毒浓度下进行。在20 ℃室温下，将线虫在接种有大肠杆菌OP50的NGM（线虫生长培养基）平板上培养到产卵期，然后使用强酸强碱溶液处理获得同步线虫。将同步化的线虫，随机挑取50 条至加药组（1、10、50 mmol/L FA）与对照组，此时记为第0 天，20 ℃下培养，每天同一时间将线虫转移至新的同浓度培养皿内，并观察线虫的存活情况。线虫死亡及剔除标准：无运动迹象，用铂丝轻触后10 s 无反应；线虫因爬出培养皿失踪或贴壁致死的不计入数据。实验重复3 次，整理数据并绘制曲线。使用Graphpad软件进行统计分析，并计算Kaplan-Meier寿命和P值。实验重复3 次，整理数据并作图。

1.4 抗应激实验

将同期化的野生型N2 线虫随机挑取50 条至加药组（1、10、50 mg/mL FA）与对照组，预先培养6 d 后进行应激实验。在热冲击实验中，线虫暴露于37 ℃培养箱中进行应激，每小时统计一次寿命，直到所有线虫死亡为止。实验重复3 次，整理数据并作图。氧化应激实验与抗热应激实验的线虫培养方法相同，将同期化的野生型N2 线虫随机挑取50条至加药组（1、10、50 mg/mL FA）与对照组，预先培养6 d 后进行应激实验。在急性氧化应激实验中，线虫暴露于每10 mL 含10 µL 30 mmol/L 双氧水的NGM 培养基中，每小时统计1 次寿命，直到线虫全部死亡为止。实验重复3次，整理数据并作图。

1.5 体长和脂褐素积累分析

将同期化的野生型N2 线虫随机挑取30 条至加药组（1、10、50 mg/mL FA）与对照组，预先培养5 d 后，将线虫放在载玻片滴有1%琼脂糖垫上，并用NaN3（20µmol/L）麻醉。在荧光显微镜下观察线虫（激发波长：340～380 nm；发射波长：430 nm，10×）。使用Image J 8.5 软件测量线虫的荧光强度和体长。实验重复3 次，整理数据并作图。

1.6 产卵实验

将同步化的L4 期野生型N2 线虫，随机挑取1 条至加药组与空白对照组，每组10 个培养皿，此时记为产卵第1 天，每隔24 h 将线虫挑至新培养基中，每天记录虫卵数目（产卵量），连续记录4 d计算总产卵量。实验重复3 次，整理数据并作图。

1.7 衰老相关基因测定

使用定量实时PCR 确定抗衰老相关基因的表达。将同期化线虫分别在空白和含有不同浓度阿魏酸的NGM 培养基中培养5 d后，采用TRIzol从大约1 000 条线虫中提取总RNA，并采用定量RT 试剂盒提取cDNA。使用实时荧光定量PCR 检测系统，使用SYBR green 对实时荧光定量PCR 进行评估。引物如表1 所示，act-1作为参考基因，使用2-ΔΔCt法分析比较基因表达水平。

表1 线虫抗衰老相关基因实时定量PCR引物Table 1 Real-time quantitative PCR primers for C.elegans aging-related genes

1.8 DAF-16::GFP 核易位测定

本实验采用TJ356 突变体线虫，该品系线虫特异性标记了DAF-16：：GFP（zls356）。将同步化的TJ356 突变体用FA 处理6 d，然后用NaN3（20µmol/L）固定在2%琼脂糖垫中，然后在荧光显微镜下观察（激发波长：460～495 nm；发射波长：510～550 nm，10×）。将DAF-16：：GFP的表达模式评估为“胞质定位”和“核定位”，并计算DAF-16 蛋白定位在每个治疗组中的百分比。

1.9 数据处理

使用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示。通过单因素方差分析（oneway ANOVA）和独立样本t检验（independent-samplesttest）对观察到的差异进行统计学检验，P＜0.05（双侧）为差异具有统计学意义。所有实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 阿魏酸对线虫寿命的影响

使用不同浓度的阿魏酸（500µmol/L）和1、10、50、100 mmol/L 对野生型N2 线虫进行处理后，对线虫寿命的影响示于图1 和表2。在给予500µmol/L和1、10、50、100 mmol/L阿魏酸后，秀丽隐杆线虫寿命明显延长（P＜0.05），且呈浓度依赖趋势，但阿魏酸在1～50 mmol/L 范围内延寿效果最为明显，故本研究选取1、10 和50 mmol/L 浓度梯度进行实验。与对照组相比，给予阿魏酸后线虫的平均寿命由（12.89±0.2）d 分别增加至（14.49±0.21）、（15.41±0.11）、（17.01±0.13）d，线虫的寿命分别延长了12.41%、19.55%、31.96%。对4组线虫寿命检测比较，经单因素方差分析，4 组间差异具有统计学意义（F=271.482，P＜0.001）；采用LSD-t检验进一步作两两比较，我们发现与对照组相比，阿魏酸（1、10、50 mmol/L）处理后的秀丽隐杆线虫寿命明显增加（P＜0.001、P＜0.001和P＜0.001；表2，图1）。

2.2 阿魏酸对线虫抵抗应激能力的影响

图1 秀丽隐杆线虫寿命曲线Fig.1 Lifespan curve of C.elegans

表2 阿魏酸对线虫寿命的影响Table 2 Effects of ferulic acid on lifespan of C.elegans

将秀丽隐杆线虫暴露于热应激和氧化应激环境下，比较处理组与对照组对寿命的影响。经过热应激处理后（图2A），对照组中线虫的平均存活时间为（6.81±0.13）h，而50 mmol/L 阿魏酸处理组的线虫的平均存活时间可延长至（8.35±0.43）h。4组线虫寿命检测比较，经单因素方差分析，4 组间差异具有统计学意义（F=9.825，P＝0.005）；采用LSD-t检验进一步作两两比较，与对照组相比，阿魏酸在10 mmol/L 和50 mmol/L 时抗热应激力明显增加（P=0.019，P=0.001）。接下来，我们采用双氧水急性应激实验来测试阿魏酸的抗氧化能力（图2B）。结果显示，阿魏酸处理组可将线虫的寿命从（4.16±0.16）h 最高延长到（5.14±0.24）h。同样，我们使用单因素方差分析对4 个不同浓度组进行寿命比较，与对照组相比，4 组间差异具有统计学意义（F=6.571，P＝0.015）；采用LSD-t检验进一步作两两比较，与对照组相比，阿魏酸在1 mmol/L 时抗应激能力没有明显差异（P＞0.05），但在10 mmol/L和50 mmol/L时抗氧化应激力明显增加（P=0.016，P=0.003）。

2.3 阿魏酸对线虫体长和脂褐素的影响

图2 阿魏酸对应激抵抗的影响Fig.2 Effectsofferulicacidonstressresistanceof C.elegans

表3 阿魏酸对线虫应激抵抗的影响Table 3 The stress resistance of ferulic acid in C.elegans

接下来，我们比较了不同处理组中线虫的体型。经过单因素方差分析，比较四组的虫体长度，结果表明虫体长度间无统计学差异（F=0.101，P＞0.05；图3）。接着我们继续测量了线虫的脂褐素积累情况。比较四组的脂褐素积累情况，经单因素方差分析，四组间的脂褐素积累差异具有统计学意义（F=20.752，P＜0.001；图4）。采用LSD-t检验进一步作两两比较，10 mmol/L 和50 mmol/L 阿魏酸组线虫的脂褐素含量比对照组分别降低了13.3%、28.3%（P=0.008、P＜0.001）。

图3 阿魏酸对线虫体长的影响Fig.3 Effects of ferulic acid on body length of C.elegans

2.4 阿魏酸对线虫繁殖力的影响

为证实该药物是否会对线虫产生副作用，我们进行了繁殖力测定。结果表明，与对照组相比，在分别补充1、10、50 mmol/L 阿魏酸后的线虫在子代总数上差异无统计学意义（P＞0.05；图5）。这些结果表明阿魏酸对线虫的繁殖力没有明显副作用。

2.5 衰老相关基因的表达

图4 阿魏酸对线虫脂褐素的影响Fig.4 Effects of ferulic acid on the lipofuscin accumulation of C.elegans

图5 阿魏酸对线虫繁殖力的影响Fig.5 Effects of ferulic acid on the total breeding population of C.elegans

综合图1～5 的结果，阿魏酸可延长线虫衰老，并且在50 mmol/L 时效果最佳，但是影响这些作用的机制尚不清楚。因此，我们选择了此浓度用于后续的研究。首先，我们确定了与寿命相关的基因的表达水平。结果表明，阿魏酸可以明显影响age-1、daf-2、akt-2、daf-16的表达（图6）。对照组的基因表达定义为1。与对照组相比，在阿魏酸处理后，线虫体内的age-1，daf-2，akt-2的基因表达量分别下调至0.79±0.04、0.65±0.16、0.59±0.32（P＜0.001、P=0.002、P=0.033）。同时，daf-16mRNA 的相对表达量较空白组相比升高至1.44±0.11（P=0.002）。

2.6 阿魏酸对 daf-2（DR1572）和 daf-16（CF1038）秀丽隐杆线虫寿命的影响

daf-2和daf-16基因通过胰岛素信号通路（IIS）调控线虫的应激抗性和寿命。我们确定了阿魏酸是否能影响daf-2（DR1572）的突变体daf-16（CF1038）秀丽隐杆线虫的寿命（图7，表4）。阿魏酸处理后，daf-2（DR1572）突变体的平均寿命没有明显增加（P＞0.05），daf-16（CF1038）秀丽隐杆线虫的平均寿命也未见明显延长（P＞0.05）。

图6 阿魏酸对衰老相关基因表达的影响Fig.6 Effects of ferulic acid on expression of senescence related genes

图7 阿魏酸对突变体线虫寿命的影响Fig.7 Effect of ferulic acid on the lifespan of mutant Nematodes

2.7 DAF-16核定位

daf-16是胰岛素信号通路中主要的转录因子，可调节秀丽隐杆线虫的寿命和应激抵抗性，DAF-16 的核定位对于下游基因的激活至关重要。因此，我们利用转基因菌株DAF-16：：GFP观察其核易位并确定了阿魏酸对DAF-16 核定位的影响（图8）。GFP 信号分为胞质定位或核定位。结果表明，被50 mmol/L 阿魏酸处理后DAF-16：：GFP 在细胞核定位的线虫比例从（5.3±1.5）%增加到（28±3）%（P＜0.001）。

表4 阿魏酸对daf-2（DR1572）突变体和daf-16（CF1038）秀丽隐杆线虫寿命的影响Table 4 Effect of RE on the lifespan of daf-2（DR1572）mutants and daf-16（CF1038）mutants C.elegans

2.8 阿魏酸对daf-16下游基因表达的影响

以上结果表明，突变体的寿命与DAF-16 的调控密切相关，转录因子DAF-16 可以调控下游基因，延长线虫的寿命。因此，我们确定了daf-16下游基因的表达水平（sod-3，ctl-2，dod17和clk-1；图9A）。对照组的基因表达定义为1。与对照组相比，加药组的野生型N2 菌株中，sod-3和ctl-2的相对表达水平上调至1.69±0.33 和1.38±0.12（P=0.021，P=0.005；图9A），并且dod17和clk-1相对表达水平分别下调至0.46±0.07 和0.74±0.18（P＜0.001，P=0.002；图9A）。然而，通过比较daf-16（CF1038）秀丽隐杆线虫中的基因表达（图9B），发现50 mmol/L 阿魏酸处理组与对照组相比，sod-3，ctl-2，dod17和clk-1的mRNA表达没有明显差异（P＞0.05；图9B）。

3 讨论

衰老过程中伴随着人体免疫功能的下降，生理完整性逐渐丧失，导致功能受损并加剧了许多慢性疾病［15］。尽管老化是不可逆的过程，但老化速度可以延迟［16］。饮食干预是一种抗衰老和改善健康的有效非遗传方法。马齿苋可以通过胰岛素/IGF-1样信号通路来提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，并且降低活性氧和丙二醛的含量从而增强秀丽隐杆线虫的抗逆性并延长寿命［17］。忍冬提取物的3 种主要化合物（绿原酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸和1，3-二咖啡酰奎尼酸）的组合可显著延迟由Aβ 毒性引起CL4176 品系秀丽隐杆线虫的麻痹［18］。蓝莓提取物可以通过在胰岛素/IGF 信号传导途径和DAF-16 延长线虫寿命，改善健康指标并且增强应激抵抗能力［19］。

图8 阿魏酸对DAF-16核转位的影响Fig.8 Effects of ferulic acid on nuclear translocation of DAF-16

图9 阿魏酸对DAF-16下游基因的影响Fig.9 Effects of ferulic acid on the downstream genes of DAF-16

阿魏酸是一种常见的多酚化合物，多见于蔬菜，尤其是洋蓟、茄子（约占总多酚的90%）和玉米糠（约占总多酚的3.1%）［20］。同时，它也是一种含有多种生物活性的植物化学单体，先前已有研究［21］表明阿魏酸在体外具有抗氧化性、抗炎活性以及有助于抵抗神经退行性病变，它被认为在预防各类疾病和促进健康方面效果显著。然而，阿魏酸的抗衰老活性及其作用机制尚未见报道。在当前的研究中，我们采用秀丽隐杆线虫作为模式动物，系统的探究了阿魏酸对线虫衰老的影响。同空白对照组相比，阿魏酸能够显著延长野生型线虫N2 的寿命。随着秀丽隐杆线虫的衰老，它们对外部刺激的抵抗力急剧下降，内源性ROS的增加进一步加速了衰老过程，形成了恶性循环。于是我们测试了线虫的抗应激能力，结果发现阿魏酸可明显提高线虫在抗氧化应激和抗热应激环境下的寿命，降低来自过氧化氢和热应激所诱导的氧化损伤和热冲击。体长和脂褐素都是评估线虫健康状况的常用指标。寿命的增加通常伴随着其他生理指标的降低。我们发现阿魏酸能够明显减少脂褐素在线虫中的沉积并且不影响体型的变化。上述实验证明，阿魏酸可以有效延长线虫的寿命，提高对环境的应激能力，并降低线虫脂褐素的积累水平，而对线虫的体长没有显著影响。但是，一些研究人员观察到寿命的延长可能与生殖力的下降有关。因此，我们进行了繁殖力测定以阐明阿魏酸是否对线虫有副作用。结果显示，阿魏酸对线虫的繁殖力没有明显的副作用。阿魏酸可能不会影响种系信号导致的生殖细胞的生育变化，例如精子发生和卵子生成，也不会影响其生长速率［22］。同时不影响线虫的产卵量和体型，体现出抗衰老作用。胰岛素/IGF-1信号传导（IIS）途径是调节秀丽隐杆线虫衰老的主要途径，该途径从DAF-2 胰岛素受体通过AGE-1/PI3K 到AKT-1/2，再到DAF16/FOXO 转录因子，从而控制线虫的寿命和相关代谢［23］。为探究阿魏酸延长秀丽隐杆线虫是否涉及此条通路，我们首先测定了通路中几个主要基因的表达。本实验结果表明，在阿魏酸处理后，age-1、daf-2和akt-2基因的mRNA 相对表达水平分别下调，且daf-16基因的mRNA相对表达水平上调（P=0.002）。此外，通过对通路上两种基因突变体线虫daf-2（DR1572）和daf-16（CF1038）的进一步研究，发现阿魏酸处理组与对照组的突变体线虫的寿命之间没有显著差异性，线虫在缺失daf-2和daf-16基因后，阿魏酸的延寿效果消失。以上结果表明，阿魏酸可能通过胰岛素daf-2/daf-16 延长线虫寿命。DAF-16 是胰岛素信号通路调控应激抵抗和长寿的关键因子，它主要分布在细胞质中，当被磷酸化并激活时，会导致其在细胞核中积累，从而激活其功能以调节下游靶基因，例如sod-3、ctl-2、clk-1和dod-17，这几个基因在新陈代谢、氧化应激和衰老中起着重要作用［24］。我们的进一步研究发现，经过阿魏酸处理后，促进了DAF-16的核定位，并上调其下游基因sod-3、ctl-2基因的mRNA表达，同时下调dod-17和clk-1基因的mRNA 表达水平。Song 等［25］研究发现，激活daf-16基因可促进其核定位以及调节下游靶基因的表达，提高应激抵抗力并延长寿命与本实验结果相似。

综上所述，阿魏酸可通过胰岛素/IGF-1信号通路和DAF-16 增强线虫的抗应激能力，延长线虫寿命，改善健康水平。本研究结果为阿魏酸的研究和开发进一步提供了有力的理论基础，但寿命调控机制错综复杂，有待于继续深入探究。