活体情况下评价载脂蛋白A1对小鼠视网膜血管生成的影响

苏焜仪，胡安娣娜，陈珠婷，连 玉，吕 林，胡 洁

（中山大学中山眼科中心//眼科学国家重点实验室，广东广州 510060）

血管生成是指从现有的血管系统中形成新的血管［1］。血管闭塞、血管生长不足和高血糖导致的视网膜缺氧被确定为病理性血管形成的主要诱因，表现为血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）破坏、视网膜微血管渗漏等。如何保护BRB 成为研究的热点。近来研究发现，血脂升高是糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的危险因素之一［2-3］。其中，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）水平与DR 的严重程度呈负相关［4］。HDL 及其主要成分载脂蛋白A1（Apolipoprotein A1，apoA1），病理状态下具有抗动脉粥样硬化、脂肪内逆行转运、抗氧化、抗炎等作用［5-9］。我们前期实验显示PDR 患者血清载脂蛋白A1（apoA1）水平降低；体内外apoA1 均能促进occludin的表达，提示apoA1具有保护视网膜屏障的作用，论文待发表。apoA1是否对视网膜血管生成有影响尚未有研究报道。视网膜成像系统是一种非侵入性的眼科学成像技术，它使视网膜血管可视化，可用于研究视网膜血管发育生长和血管结构的完整性［10］，评估血管渗漏和新生血管生成的情况，如对氧诱导的视网膜病变（oxygen-induced retinopathy，OIR）模型以及健康的小鼠视网膜进行无创体内活体评估。本研究拟采用小鼠视网膜成像系统，实现视网膜血管的可视化，实时观察apoA1是否会影响生理条件及缺氧环境下的小鼠视网膜血管，从而全面评估apoA1对小鼠视网膜血管的作用。

1 材料与方法

本实验所用SPF 级C57/BL6J 小鼠均从广东省实验动物中心购买，所用apoA1+/+鼠（品系名称：C57BL/6 Tg（APOA1）1Rub/J）及apoA1-/-小鼠（品系名称：B6.129P2-Apoa1tm1Unc/J）均从Jackson Lab购买，国内上海南方模式生物科技有限公司净化成SPF 级小鼠后，饲养于中山大学中山眼科中心实验动物中心SPF 级饲养间，饲养间内湿度控制在40%～70%，温度控制在（21 ± 1）°C，水及食物充足。本实验所用所有的动物均遵守视觉与眼科学研究学会（ARVO）协定中动物使用原则，并且经过中山大学中山眼科中心动物伦理委员会批准，未检测出微生物。

1.1 研究对象

常氧组研究对象分3 大组：①健康SPF 级C57BL/6 Tg（APOA1）1Rub/J 小鼠组（apoA1基因过表达小鼠，简称：apoA1+/+）；②健康SPF 级B6.129P 2-Apoa1tm1Unc/J 小鼠组（apoA1基因敲除小鼠，简称：apoA1-/-）；③对照组：健康SPF 级C57/BL6J 小鼠组（正常对照组，简称：normal）。选择时间点，分3组：①第17天末（幼年鼠）；②8周龄（成年鼠）；③20周龄（中老年鼠）。各组各时间点小鼠样本量5 只，常氧组总样本量为45只。

缺氧组研究对象分3 大组：①C57BL/6 Tg（APOA1）1Rub/J 小鼠OIR 模型组（apoA1转基因小鼠OIR 模型，简称：apoA1+/+OIR）；②B6.129P2-Apoa1tm1Unc/J 小鼠OIR模型组（apoA1基因敲除小鼠OIR 模型，简称：apoA1-/-OIR）；③对照组：C57/BL6J小鼠OIR模型组（简称：normal OIR）。

取P7 的C57BL/6 乳鼠、apoA1+/+乳鼠及apoA1-/-乳鼠进行造模，即OIR 模型。具体做法：放入含氧体积分数为75%的饲养箱中，P12 再将其放回正常室内空气中饲养5 d，所有动物皆饲养于屏障环境动物实验室中。选择时间点：小鼠出生后第17天末。各分组小鼠样本量5只，缺氧组总样本量为15只。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质免疫印迹 蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）法首先剥出视网膜组织，用200 µL RIPA 缓 冲 液+1/100 PMSF，在4 ℃条 件 下 作 用30 min，提取蛋白。以转速12 000×g在4 ℃条件低温离心20 min，用BCA法测定蛋白浓度。在10%的SDS-丙烯酰胺凝胶上样30 µg 蛋白进行电泳。电泳后，将蛋白电转至PVDF 膜。常温下用5%脱脂牛奶在TBST 缓冲液（5 mmol/L）中封闭1 h，阻断非特异性结合位点。用apoA1（鼠抗，1：1 000）和GAPDH（兔抗，1：1 000）于4 ℃过夜。用TBST 洗膜，每次10 min，需洗3 次。分别用对应种属的二抗（1：1 000）室温下孵育二抗1 h。用TBST洗膜，每次10 min，需洗3 次。1：1 加入曝光液A 和B，在凝胶成像仪内曝光。

1.2.2 小鼠体质量记录 在活体情况下进行，记录各组各时间点的小鼠的体质量，取平均值后进行比较。

1.2.3 活体眼底照相 应用Micron Ⅳ摄像系统（Phoenix Research Laboratories，San Ramon，CA），取各组各时间点的小鼠，35%水合氯醛（注射剂量为0.1 mL/10 g）腹腔下注射进行全身麻醉，麻醉后再固定小鼠，利用复方托吡卡胺滴眼液给小鼠眼睛散瞳，右旋糖酐羟丙甲纤维素滴眼液保护角膜，调整进光角度，进行小鼠活体眼底照相。

1.2.4 荧光眼底血管造影 小鼠活体眼底照相后，腹腔下注射10%荧光素钠（注射剂量为0.1 mL/10 g）后，行荧光眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA），活体观察视网膜血管的变化。在活体状态下观察到迂曲和扩张的视网膜血管，同时留意无灌注区，对视网膜血管病变可进行动态检测。采用AngioTool 软件分析视网膜的血管密度、孔隙率、连接点个数。血管密度定义为血管面积与总体面积之比，它能够反映视网膜微血管的改变，体现血-视网膜屏障破坏的严重程度。孔隙率定义为孔隙体积占总体体积的百分比，它反映血管的不均匀性，间接反映无灌注区的大小。连接点个数则指分析图片范围内血管分支点的个数，间接反映视网膜血管的分支生成情况。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 6 及SPSS 24 软件对实验数据进行分析，数据首先进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐性的数据，对单因素变量资料采用One-way ANOVA 单因素方差分析，总的方差分析有统计学意义时采用Bonferroni法进行两两比较。对双因素变量资料采用Twoway ANOVA 双因素方差分析法，总的方差分析有统计学意义时两两比较采用Bonferroni 法。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 提前验证性试验

为了验证动物模型的有效性，我们通过Western Blot 实验进行检测。通过统计学分析（单因素方差分析），组间差异有统计学意义（F=739.19，P＜0.000 1，n=3；图1），采用Bonferroni 法作两两比较，发现正常组与apoA1+/+组、正常组与apoA1-/-组比较差异有统计学意义（P＜0.000 1）。验证apoA1+/+小鼠apoA1过表达，apoA1-/-小鼠已缺失apoA1，为后续研究结果的可信性奠定了基础。

图1 小鼠肌肉apoA1含量统计图Fig.1 The relative expression of apoA1 in various mice muscle

2.2 各组各时间点的小鼠的平均体质量

在正常生理条件下，各组小鼠在不同年龄段均符合正常小鼠正常曲线（表1），apoA1基因的过表达及敲除情况不影响小鼠的正常发育。

表1 各组各时间点的小鼠的平均体质量Table 1 Average weight of mice at each time point in each group （，g，n=5）

表1 各组各时间点的小鼠的平均体质量Table 1 Average weight of mice at each time point in each group （，g，n=5）

2.3 正常生理条件下小鼠视网膜成像系统对小鼠视网膜血管结构评价

2.3.1 小鼠眼底照相 在正常生理条件下，3 种小鼠不同时期主要血管自视盘发出，呈放射状分枝形态，血管径直。中周部视网膜血管管径逐渐均匀变细，大血管在走形过程中逐级发出分支血管，分支血管呈纹理状衔接良好（图2）。

图2 生理条件下3种小鼠不同时期眼底照相情况Fig.2 Fundus photography of three kinds of mice in different periods under physiological condition

2.3.2 小鼠荧光造影 在正常生理条件下，3 种小鼠不同时期主要血管自视盘发出，呈放射状分枝形态，血管径直。周边部视网膜内层血管呈树叶脉络样分支及均匀走形，灌注良好，细小血管分支直达周边部。视网膜血管无明显无灌注区及荧光渗漏等表现（图3A）。血管密度（图3B）经统计学分析（双因素方差分析法），组间比较差异无统计学意义（F=0.72，P血管密度=0.59，P＞0.05，n=5）。孔隙率（图3C）经统计学分析（双因素方差分析法），组间比较差异无统计学意义（F=0.84，P孔隙率=0.52，P＞0.05，n=5）。采用Bonferroni 法作两两比较，各组间比较差异无统计学意义。连接点个数（图3D）经单因素方差分析法，组间比较差异无统计学意义（F=0.236，P连接点个数=0.797，P＞0.05，n=5）。

2.4 病理条件（缺氧）下小鼠视网膜成像系统对小鼠视网膜血管结构评价

2.4.1 小鼠眼底照相 造OIR 模型后，3 种小鼠视网膜均出现主要血管明显迂曲扩张、串珠样改变，部分区域可见片状出血，提示造模成功。3 种小鼠OIR 模型中，主要动脉、静脉迂曲扩张程度无明显差异（图4）。

图3 生理条件下3种小鼠不同时期荧光造影情况及统计图Fig.3 Fundus fluorescein angiography of three kinds of mice in different periods under physiological condition and their statistical graphs

图4 缺氧状态下P17的小鼠OIR模型眼底照相情况Fig.4 Fundus photography of OIR model of P17 in the three kinds of mice under hypoxia state

2.4.2 小鼠荧光造影 缺氧状态下，3 种小鼠视网膜均出现中央区域无灌注区形成，血管明显迂曲扩张、串珠样改变，毛细血管分布不均（图5A）。中央视盘呈高荧光状态，腹腔下注射造影剂1 min后，部分区域可见不同程度的片状荧光渗漏。其中，无灌注区面积比较：apoA1-/-OIR ＞正常小鼠OIR ＞apoA1+/+OIR。荧光渗漏出现时间，从早到晚排序：apoA1-/-OIR ＞正常小鼠OIR ＞apoA1+/+OIR。三组小鼠OIR 模型血管密度经统计学分析（One-Way ANOVA），组间比较差异有统计学意义（F=22.56，P血管密度=0.001 6，P＜0.01，n=5；图5B）。采用Bonferroni 法进一步作两两比较，发现正常小鼠OIR 组与apoA1+/+OIR 组比较差异有统计学意义（P=0.008 6，P＜0.01），apoA1+/+OIR 组与apoA1-/-OIR 组比较差异有统计学意义（P=0.001 8，P＜0.01），而正常小鼠OIR 组与apoA1-/-OIR 组比较差异无统计学意义（P=0.42，P＞0.05）。3 组小鼠OIR 模型孔隙率经统计学分析（One-Way ANOVA），组间差异有统计学意义（F=21.08，P孔隙率=0.001 9，P＜0.01，n=5；图5C）。采用Bonferroni 法进一步作两两比较，发现正常小鼠OIR 组与apoA1-/-OIR 组比较差异有统计学意义（P=0.011，P＜0.05），apoA1+/+OIR 组与apoA1-/-OIR组比较差异有统计学意义（P=0.002 0，P＜0.01），而正常小鼠OIR 组与apoA1+/+OIR 组比较差异无统计学意义（P=0.41，P＞0.05）。同样方法分析连接点个数，组间差异有统计学意义（F=27.64，P连接点个数=0.001 3，P＜0.01，n=5；图5D）。采用Bonferroni 法进一步作两两比较，发现正常小鼠OIR 组与apoA1-/-OIR 组比较差异有统计学意义（P=0.007 2，P＜0.01），apoA1+/+OIR 组与apoA1-/-OIR 组比较差异有统计学意义（P=0.001 2，P＜0.01），而正常小鼠OIR 组与apoA1+/+OIR 组比较差异无统计学意义（P=0.24，P＞0.05）。

图5 缺氧状态下P17的3种小鼠OIR模型荧光造影情况Fig.5 Fundus fluorescein angiography of OIR model of P17 in the three kinds of mice under hypoxia state

3 讨论

apoA1 是血清高密度脂蛋白颗粒中主要的蛋白质成分，反映了血管组织中脂质积累。它是一种相对较大的蛋白质，含有243 个氨基酸残基。它参与脂肪分子的逆行转运、血清胆甾醇酯的形成和抗凝血过程，具有显著的抗氧化、抗炎和抗动脉粥样硬化作用。本研究采用动物视网膜成像系统在活体情况下对小鼠视网膜血管进行观察，并用血管密度、孔隙率、连接点个数等指标反映视网膜微血管的改变。我们运用的小鼠眼底照相及眼底荧光造影，具有视网膜实时成像的特点［10］，在不需要牺牲小鼠的情况下，监测生理及病理条件下的视网膜血管变化。通过上述指标同样可以评价视网膜血管生长及破坏情况。并用C57BL/6 小鼠的三大关键时期（幼年期、成年期、中老年期）模拟小鼠的生长周期，以此首次探讨在正常生理条件下，apoA1基因表达量的多少对小鼠视网膜血管生长发育的影响。

Rubin等［11］最早于1990年构建apoA1过表达小鼠模型，用于研究apoA1转基因表达改变后，涉及小鼠apoA1血浆水平的机制。过表达模型构建后，其血清HDL 水平大约是正常水平的两倍。apoA1在决定高密度脂蛋白颗粒大小分布方面起主导作用。随后，有研究利用apoA1过表达小鼠证明它可以降低饮食诱导发生的大动脉粥样硬化病变的风险［12］。为确定实验性降低血浆高密度脂蛋白水平是否会增加动脉粥样硬化易感性，Williamson 等［13］于1992 年利用基因靶向技术来产生apoA1基因敲除小鼠模型。尽管与正常小鼠相比，apoA1基因敲除纯合子小鼠缺乏apoA1蛋白，它们在3 月龄时仍健康生长。这一事实证明了apoA1对小鼠的正常发育并不是至关重要的。该模型的有效存活为更好地研究apoA1缺失在脂质代谢和动脉粥样硬化的发生的影响提供了可能。

我们研究发现，正常情况下apoA1过表达对视网膜血管生成无影响。我们可见3 种小鼠在幼年、成年、中老年时期中观察到视网膜血管的生长发育上未见明显异常，其表现为主要血管自视盘发出，呈放射状分枝形态，血管径直，毛细血管分布均匀，无明显无灌注区，无新生血管形成。我们可知，HDL 除了参与胆固醇逆向转运外，HDL 有血管保护作用，包括内皮细胞功能保护作用、抗炎作用、抗血栓作用、抑制血管平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）增殖［14］等作用。ApoA1是高密度脂蛋白中含量最丰富的成分，它有着与HDL 相似的作用。我们猜测，在正常生理情况下，无显著刺激因素，未能诱导机体产生氧化还原应激反应、炎症反应等，apoA1高表达情况下，调节内皮细胞、调节血管生成、调节内外膜功能等血管保护作用未能凸显，血管依旧正常生成，呈正常血管分布形态。因此，apoA1过表达小鼠模型，其血管正常发育与正常小鼠相比无明显改变。

我们的研究也显示在正常情况下，apoA1缺失对视网膜血管生成无影响，分析原因如下：首先，本研究模拟小鼠正常条件下，观察apoA1对视网膜血管生成的影响，而apoA1与脂质代谢息息相关，下一步研究将对各组小鼠的血脂状况进行测量，做组织切片对小鼠的大血管壁进行病理观察，以进一步验证。其次，组织脂质堆积在病变晚期时症状才凸显。apoA1-/-小鼠模型，可模拟临床上的丹吉尔病（tangier disease，TD），这是一种罕见的遗传病，其临床特征是血浆高密度脂蛋白水平严重降低，外周组织脂质积累，心血管疾病风险增加［15］。而在眼科中曾有报道，患者年轻时双眼无明显病变，其重要临床表现为成年后逐渐出现角膜混浊，活检标本中显示结膜血管周细胞变性，细胞见双折射脂质颗粒［16］，对全身血管系统的发育无影响。而本研究中小鼠研究至中老年期，可能未能诱导出相应血管改变。

我们的研究结果还显示：缺氧状态下，3 组小鼠的OIR 模型在眼底照相中均可发现主要血管明显迂曲扩张、串珠样改变，部分区域可见片状出血。主要动脉、静脉迂曲扩张程度无明显差异。说明对于主要血管，抵抗氧化应激所导致的迂曲扩张的作用不显著。3 组小鼠造OIR 模型后，在荧光造影中均可见大量的无灌注区，荧光渗漏，血管的扩张、扭曲和闭塞。血-视网膜屏障均有不同程度的破坏，视网膜内皮细胞间的紧密连接屏障发育不完善，并且更重要的是，apoA1表达量增高，可见视网膜血管的荧光渗漏减少，视网膜无灌注区面积减少。血管密度的统计学差异，说明apoA1能抵抗缺氧对视网膜血管屏障的破坏，维持血管网络的稳定；孔隙率的统计学差异提示apoA1对视网膜血管的无灌注区生成有一定的抑制作用，使无灌注区减少，连接点个数的统计学差异说明apoA1对视网膜血管的生长发育、分支生成毛细血管网有一定的保护作用，综上证据提示apoA1对视网膜血管屏障有保护作用。

我们推测apoA1保护视网膜血管无灌注区、减少渗漏的可能机制为［17］：脂质内逆向转运作用。apoA1是脂质在视网膜内逆向转运的关键因素［18］，它促进胆固醇从外周组织转运到肝脏，从而防止脂质在视网膜内积聚。抗氧化作用。LDL 的氧化可导致平滑肌细胞毒性和血管内皮功能障碍，apoA1可以促进血管保护机制［19］，具有抗氧化作用，抑制LDL 的氧化，通过清除有害的氧化脂质，抵抗视网膜受到氧化应激的损害。保护内皮细胞作用。已有研究表明，较高水平的apoA1可改善冠状动脉的血管内皮功能［20］，对于微血管病变，其作用亦然，它可以调节血管内皮细胞。重组HDL（reconstituted HDL，rHDL）可以刺激内皮祖细胞（EPCs）的分化，并增强EPCs 介导小鼠的内皮修复。一氧化氮（NO）可使血管扩张，apoA1对内皮细胞NO 依赖性血管舒张和血流调节具有生理作用，保护内皮细胞减少损害。调节内外膜功能。一方面，HDL调节内膜内皮功能、血小板活化和血栓形成、炎性细胞因子分泌、泡沫细胞形成和SMC 增殖，抑制内膜增生。另一方面，HDL具有调节外膜成纤维细胞分化和血管周围脂肪细胞功能的潜能，它可能与胆固醇转运相结合，减少血管重构［21］。

视网膜成像系统具有无创、实时、血管可视化的特点，本文通过视网膜成像系统，活体观察apoA1正常生理状态下及缺氧状态下对视网膜血管生长情况的影响，发现在生理条件下，apoA1基因表达量的多少对视网膜血管生长无影响；而缺氧状态下，apoA1表达量增高可使视网膜无灌注区面积减少，荧光渗漏减少，提示apoA1对视网膜血管屏障有保护作用，为视网膜新生血管疾病提供新思路，而且对其他微血管疾病及大血管疾病的发生发展也有提示作用。