微卫星状态对结直肠癌根治术(微创)淋巴结检出数量的影响

张冬生，封益飞，王 勇，胥子玮，黄远健，张 川，孙跃明，唐俊伟

(南京医科大学第一附属医院直肠外科，江苏 南京，210029)

结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占我国所有恶性肿瘤的第3位，死亡率占第5位，分别为28.20/10万、13.61/10万[1]。目前，结直肠癌的治疗仍以手术为主，辅以化疗、放疗等治疗方式的综合治疗模式。淋巴结数量是结直肠癌根治术的重要指标，与患者预后密切相关。淋巴结数量因患者的年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤部位等不同而存在差异[2]。此外，患者自身及肿瘤的生物学特征同样影响淋巴结数量。微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是结直肠癌的重要分子病理指标，与患者预后存在一定相关性。微卫星是遍布于基因组中的短串联重复序列。MSI状态是由于错配修复基因发生缺陷导致重复序列长度的改变，通常包括以下三种状态:高度微卫星不稳定性(microsatellite instability-high，MSI-H)、低度微卫星不稳定性(microsatellite instability-low，MSI-L)、微卫星稳定性(microsatellite-stable，MSS)。既往研究表明，MSI-H结直肠癌具有较特殊的临床病理特征，包括：(1)肿瘤原发部位多位于右半结肠；(2)女性多见；(3)分化程度较差；(4)黏液成分多见；(5)肿瘤边缘呈膨胀性浸润，T分期较晚，肿瘤浸润淋巴细胞多见，周围可见克罗恩病样淋巴细胞反应；(6)区域淋巴结转移较少；(7)同时发生BRAF突变较多，约占50%，而KRAS突变较少。此外，既往研究表明，MSI状态与淋巴结检出数量具有一定相关性，MSI-H患者淋巴结检出数量可能更多[3-8]。本研究采用回顾性研究的方法，旨在进一步论证MSI状态对结直肠癌根治术淋巴结检出数量的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 采用回顾性研究的方法纳入2015年1月至2019年12月南京医科大学第一附属医院结直肠外科收治的1 280例结直肠根治术患者。纳入标准：(1)病理确诊为结直肠原发性腺癌；(2)接受结直肠癌根治术(D3淋巴结清扫)；(3)限期手术。排除标准：有肠癌病史、非R0切除、合并其他恶性肿瘤、多原发结直肠癌、结直肠肿瘤家族史、阑尾肿瘤、肛管肿瘤、术前辅助放化疗、炎症性肠病。本研究符合《赫尔辛基宣言》的要求。患者及家属均签署手术知情同意书。

1.2 观察指标 人口学特征：性别、年龄、BMI、术前血清CEA及CA19-9。手术标本病理学检查：肿瘤部位、TNM分期、T分期、N分期、M分期、肿瘤分化、印戒细胞、黏液分化、病理形态、肿瘤最大直径、癌结节、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结清扫数量、阳性淋巴结数量。微卫星状态：根据MSI状态将纳入患者分为MSI-H组与MSS/MSI-L组。

1.3 PCR-毛细管电泳检测微卫星状态 选取结直肠癌组织蜡块进行切片脱蜡提取DNA，采用MSI检测试剂盒扩增结直肠癌组织中BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250等5个Bethesda标准位点的突变状态，当癌组织存在2个及2个以上突变位点时判定为MSI-H，仅存在1个位点突变时判定为MSI-L，无位点存在突变则判定为MSS。

1.4 手术方法 采用气管插管全身麻醉。手术均由同一手术治疗组完成。根据肿瘤部位决定手术方式，按照全结肠系膜切除术(complete mesocolic excision，CME)或全直肠系膜切除术(total mesorectal excision，TME)的方法施行腹腔镜结直肠癌根治术(D3淋巴结清扫)。直视下锐性分离结直肠脏壁层筋膜间隙，将病灶肠段连同系膜及系膜根部淋巴结脂肪组织完整切除，清扫的淋巴结包括肠旁、中间、中央淋巴结。

1.5 统计学处理 采用SPSS 23.0软件进行数据分析。非正态分布数据采用M(P25，P75)表示，组间比较采用Mann-WhitneyU、Kruskal-WallisH检验。分类、等级资料以绝对数或百分比表示。将单因素分析筛选出的潜在影响因素作为自变量(P<0.1)，淋巴结检出数量作为因变量进行Poisson回归多因素分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

1 280例患者中男800例(62.5%)，女480例(37.5%)，中位年龄63(26～91)岁，右半结肠癌337例(26.3%)，左半结肠癌398例(31.1%)，直肠癌545例(42.6%)。腹腔镜手术969例(75.7%)，达芬奇手术153例(12.0%)，开放手术158例(12.3%)。112例(8.7%)为MSI-H，79例(6.2%)为MSI-L，1 089例(85.1%)为MSS。淋巴结检出数量19(16，23.75)枚，阳性淋巴结检出数量0(0，1)。全组淋巴结转移率为31.56%(404/1280)。

单因素分析显示，1 280例患者淋巴结检出数量在不同年龄、BMI、肿瘤部位、MSI状态、肿瘤最大直径、T分期、癌结节中差异均有统计学意义(P<0.1)，见表1。进一步行多因素分析显示，年龄、BMI、肿瘤部位、MSI状态、肿瘤最大直径、癌结节是影响结直肠癌淋巴结检出数量的独立影响因素(P<0.05)，见表2。

表1 影响结直肠癌患者淋巴结检出数量的单因素分析

单因素分析显示，1 280例患者阳性淋巴结检出数量在术前CEA、术前CA19-9、MSI状态、肿瘤分化、病理类型、T分期、癌结节、脉管侵犯、神经侵犯中差异均有统计学意义(P<0.1)，见表1。进一步行多因素分析显示，术前CEA、术前CA19-9、MSI状态、肿瘤分化、病理类型、T分期、癌结节、脉管侵犯、神经侵犯是影响结直肠癌阳性淋巴结检出数的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响结直肠癌患者淋巴结检出数量的多因素分析

3 讨 论

目前，外科手术仍是结直肠癌的主要治疗方式。1982年英国学者Heald提出TME的概念用于直肠癌的手术治疗[9]。针对结肠癌，2009年德国学者Hohenberger提出CME的手术方式[10]。TME或CME均要求直视下锐性分离结直肠脏壁层筋膜的间隙，连同系膜前后的筋膜、营养血管及根部淋巴结完整切除。完整系膜切除及彻底的区域淋巴结清扫是手术关键。TME与CME的开展一方面降低了肿瘤的局部复发率，提高了生存率，改善了患者的预后，另一方面，更推动了结直肠癌手术规范化进程[11]。

结直肠癌的淋巴转移是主要的转移途径，也是导致患者术后肿瘤复发或死亡的重要原因。规范的淋巴结清扫是结直肠癌根治术的关键。淋巴结检出数量是结直肠癌手术切除标本的重要病理指标。作为TNM分期的重要依据，淋巴结转移与患者预后密切相关。淋巴结清扫数量是结直肠癌预后的独立因素。文献报道，不论淋巴结转移阳性抑或阴性，淋巴结检出越多，生存率越高[12]。对于淋巴结检出数量的要求，美国NCCN指南、欧洲ESMO指南、中国结直肠癌诊疗规范均建议至少检出12枚淋巴结。送检数量少于12枚被认为是复发的高危因素。日本JSCCR指南对淋巴结清扫数量未作硬性要求，但仍强调彻底的淋巴结清扫。

结直肠癌手术标本淋巴结检出数量受手术切除范围、病理检查、患者自身及肿瘤生物学特征的影响。研究表明，MSI-H与更多的淋巴结检出数量相关。Arnold等[13]通过1 196例结直肠癌患者的分析发现，MSI-H患者≥12枚淋巴结的比例高于MSS/MSI-L患者(91% vs.80%，P=0.004)，但可能与该组患者中右半结肠癌比例较高(84%)有关。Søreide等[14]发现，MSI-H是Ⅱ/Ⅲ期结肠癌≥12枚淋巴结检出数量的独立影响因素(校正OR2.6,95%CI：1.1-6.0，P=0.026)[14]。Kang等[15]通过对603例Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者的资料分析发现，MSI-H患者具有更多的淋巴结检出数量(中位数：31枚 vs.23枚，P<0.001)[15]。Shin等对245例Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者的分析发现，MSI-H组淋巴结检出数量[(26.3±13.1)枚 vs.(20.7±1.2)枚，P=0.04]多于MSS/MSI-L组[4]。Belt等[16]发现，65例MSI型肿瘤患者淋巴结检出10.1枚，267例MSS型肿瘤患者为8.6枚(P=0.03)，多因素分析显示，MSI状态是高淋巴结检出数量的最强独立影响因素[16]。Berg等[17]回顾了204例Ⅰ～Ⅲ期结肠癌患者的临床资料，发现79%(53/67)的MSI-H患者具有足够的淋巴结检出数量(≥12枚)，MSS/MSI-L组为61%(83/137)；多元线性回归分析显示，MSI是淋巴结检出数量的独立影响因素。由于DNA错配修复功能的缺陷，MSI肿瘤中移码突变所产生的截短肽链较常见，其免疫原性诱导机体的抗肿瘤免疫反应增强，促使肿瘤浸润淋巴细胞的大量出现。此外，MSI-H结直肠癌具有一项重要病理特征——克罗恩病样淋巴反应，即瘤周淋巴细胞大量聚集成团，星状纤维包绕，部分具有生发中心[18]。克罗恩病样淋巴反应与更多、更大的淋巴结相关，预示着较好的预后。抗肿瘤免疫反应越强，淋巴组织增生，淋巴结越大，更加容易被发现[19-20]。本研究结果表明，MSI状态是结直肠癌根治术淋巴结检出数量的独立影响因素，MSI-H患者淋巴结检出数增多，阳性淋巴结检出数较少。

然而部分研究认为，MSI状态与淋巴结检出数量无相关性[21-22]。MacQuarrie等[23]回顾分析了168例Ⅲ期结肠癌患者的临床资料，发现MSI与MSS患者淋巴结检出数量分别为15.9枚与16.9枚(P=0.664)，认为MSI状态不影响淋巴结检出数量。研究结论的差异可能受研究时间、研究方法、样本量的影响，其结论有待商榷。

本研究作为单中心的回顾性研究，存在一定的选择偏倚。然而，鉴于单中心研究中，手术切除标准、病理检查标准可得到统一，且本组病例数量较大，所得结论具有一定的临床意义。综上，微卫星状态是结直肠癌根治术淋巴结检出数量的独立影响因素，MSI-H患者淋巴结检出数增多，阳性淋巴结检出数较少。