一株鸽源巴氏杆菌的分离鉴定与耐药性分析

陈 信，丁 勇，黄志宏，厉 桓，詹 妍，张冬萱，乔宏兴

(1.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046；2.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450001)

由多杀性巴氏杆菌引起的巴氏杆菌病是一种重要的人畜共患传染病，主要引起畜禽发生出血性败血病或传染性肺炎，可以在动物之间相互传染，同时也可通过与动物接触使人感染致病[1]。多杀性巴氏杆菌多为呼吸道常见菌，不引起疾病。但在动物营养不良和抵抗力下降时，可直接或间接地导致某些疾病的发生，如禽霍乱、鸽霍乱、猪肺疫和牛呼吸道等疾病。这些疾病的高发病率和高死亡率一直严重影响国内畜牧行业的发展[2]。巴氏杆菌是一种条件致病菌，易与其他病原菌混合感染或继发感染。巴氏杆菌在饲养动物鸡、猪和牛较为常见，但在鸽子饲养中较为少见。

随着我国经济的发展和国人消费水平的不断提高，对鸽类的市场需求量也在逐年上升，鸽子养殖业发展迅速，然而鸽病的发生和流行是妨碍鸽子养殖行业发展的主要问题之一[3]。其中鸽霍乱屡有发生和流行，并且呈现上升趋势，严重危害养鸽业持续稳定发展。因此对鸽源巴氏杆菌的研究对鸽病的防控具有现实指导意义。

本试验从发病鸽的肝、脾等组织病料中分离出一株鸽源巴氏杆菌，利用生化试验进行细菌鉴定，通过药敏试验分析其敏感药物，了解该场鸽源巴氏杆菌的耐药情况。本研究筛选出了高度敏感的抗菌药，同时也为临床上鸽源巴氏杆菌引起的多杀性巴氏杆菌病的防治提供科学参考依据。

1 材料

1.1 培养基及主要试剂

营养琼脂：购于北京奥博星生物技术有限责任公司；犊牛血清：购于兰杰柯科技有限公司;麦康凯琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂、胰酪大豆胨液体培养基、鲜血琼脂平板、革兰氏染色液试剂盒、细菌微量生化鉴定管、药物敏感纸片：购自青岛高科技园海博生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 发病情况

驻马店一养鸽厂南北两棚均有10日龄左右乳鸽，开始发病，零星死亡。一对母鸽抚养3只乳鸽，至少死亡1只，之前未发生这种情况，最近半年几乎到这个日龄发病。抗生素用了多种，治疗后有效果但不能彻底根治，影响生产。平时防疫情况：母鸽每年3月和9月防疫新城疫和流感二联苗，以后每隔2个月饮水。

2.2 临床症状

鸽患此病后一般表现为急性经过，病鸽体温高达43～44 ℃，先是精神萎靡，食欲减退或不食，渴欲增强，频繁饮水。羽毛蓬松杂乱，后出现呼吸困难，口鼻流出泡沫状黏液。大多数鸽子有严重下痢，粪便呈灰色、铜绿色或黄白色。 整个病程1～3 天，最终死于衰竭。

2.3 剖检病理变化

剖检时可见病鸽各浆膜、皮下脂肪和心冠脂肪等处密布出血点(图1)；肝脏肿胀到几乎覆盖整个腹腔，质感脆，有针尖大小的灰白色坏死点(图2)；肠道黏膜出血，肠壁薄，尤其是十二指肠黏膜有明显的出血点。个别有腹水，气管上有出血点，肾脏肿胀。心包发炎，心包积液增多(图3)，肺出血。

图1 肝脏肿胀

2.4 培养基的配制

麦康凯培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基4.0 g，蒸馏水100 mL；胰酪大豆胨液体培养基3.0 g，蒸馏水100 mL；5%血清营养琼脂培养基3.3 g营养琼脂，5 mL犊牛血清，100 mL蒸馏水，高压灭菌备用。

图2 肝脏上灰白色坏死点

图3 各脏器出血

2.5 细菌分离培养

实验室无菌采集病鸽的肝脏，对采集的病料病变部位表面进行灼烧灭菌，分别接种于5 %血清营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、鲜血平板、TSA平板。所有平板划线结束，30 min后将平板倒扣并做标记。放入37 ℃恒温箱中，培养24 h后，肉眼观察培养基中细菌的菌落形态。

2.6 细菌形态学鉴定

待平板上长出肉眼可见的菌落后，观察菌落的形态并标记疑似多杀性巴氏杆菌的单菌落，挑取菌落用记号笔标出，涂片、固定、染色、脱色、复染均按试剂盒说明书进行革兰氏染色，干燥后，用显微镜观察，并记录结果。

2.7 细菌纯化培养

制备100 mL TSB，各取3 mL放入4只10 mL EP管，从斜面挑取菌落接种于各试管中，37 ℃, 200 r/min摇菌5～6 h；将试管中的菌液接种于三角瓶剩余TSB中，继续摇菌24 h，条件同上，观察菌液性状。取菌液接种于平板上，进行“Z”字形划线，将平板倒置于37 ℃培养箱中培养24 h。若在新板上有长出菌落，可再次划线直至完全纯化。

2.8 生化实验

用接种针从平板上挑取已纯化单个菌落，用生理盐水稀释后，与麦氏比浊管比浊，制成浓度为1.5×108CFU/mL细菌悬液，滴入上述微量生化鉴定管中，每管三滴，接种完后放37 ℃恒温培养中培养。按照说明书，不同的生化鉴定管按照不同的时间培养，观察结果并记录。

2.9 药敏实验

挑取平板上已纯化的单个菌落，制成1.5×108CFU/mL的细菌悬液，采用纸片琼脂扩散法进行药敏试验。37 ℃倒置培养24 h，观察药物纸片周围有无抑菌圈并记录各种药敏片的抑菌圈直径大小，进而为该菌株对各种药物的敏感性进行判定。

3 结果与分析

3.1 分离菌株的形态学

接种于鲜血琼脂平板生长状态良好，呈现灰褐色、半透明、稍突起、光滑、边缘整齐的湿润粘稠菌落、未出现溶血区，见图4。在麦康凯琼脂平板上不生长，见图5。在5%血清琼脂生长状态良好，形成乳白色、圆形、半隆起、湿润、表面光滑的露滴状单个菌落，见图6。在TSA平板上生长可见淡黄白色、圆形隆起、湿润、边缘整齐的露珠样菌落，见图7。

图4 12 h鲜血平板菌落形态

图5 24 h麦康凯菌落形态

图6 24 h 5%血清琼脂菌落形态

图7 12 h TSA菌落形态

3.2 细菌形态特性

革兰氏染色镜检阴性，本菌细小短杆状，多呈单个存在，很少成对或形成短链状。显微镜下见到菌体两极着染较深，不形成芽孢，无运动性，有的菌株具有荚膜，见图8。

图8 革兰氏染色 (1000×)

3.3 纯化培养

在TSB中连续培养24 h，呈现轻度混浊，瓶底出现乳白色粘稠沉淀见图9～10，纯化培养菌落形态如图11。

图9 菌液轻度混浊

图10 瓶底白色沉淀

图11 纯化培养菌落形态

3.4 生化实验

生化实验表明该菌株能利用麦芽糖、蔗糖、木糖、甘露醇和山梨醇，VP实验呈阳性;不能利用乳糖、尿素酶、硫化氢，MR实验呈阴性。分离菌株生化实验结果见表1。

3.5 药敏实验

分离的本株细菌药敏试验结果见表2。根据药敏试验结果，结合当地流行病情况，推荐首先选择庆大霉素、阿米卡星、新霉素治疗，同时采取有效的防治措施，及时隔离发病鸽，对污染的场地和鸽舍进行彻底消毒工作。2019年4月19日，该厂治疗结果反馈，病情基本得到控制。

4 讨论

多杀性巴氏杆菌是禽霍乱的重要致病菌，正常畜禽呼吸道和消化道也存在，属于一种条件致病菌[4,5]。圈舍产生气温骤变、通风不良等应激因素导致机体抵抗力下降，容易导致禽霍乱的爆发[6,7]，该病严重影响养禽业的发展。近年养鸽业经过稳步发展，已逐步走向了成熟，但无论肉鸽厂还是种鸽厂，多杀性巴氏杆菌在各大养鸽厂也经常被报道。鸽感染后常以急性型败血症为主要特征，发病率和死亡率都较高，在各地方呈散发性或地方流行性。小型养鸽厂尤为严重，所以对鸽巴氏杆菌病的诊断与防治是极其重要的。目前对多杀性巴氏杆菌病采取药物治疗进行控制，但随着抗菌药物的不合理应用，多杀性巴氏杆菌的耐药范围更广，多重耐药越来越严重[8]。2016年林志敏等[9]研究表明，多杀性巴氏杆菌的耐药种类与质粒携带特征可能有关，结果显示近期治疗禽霍乱可首选恩诺沙星、利福平、头孢唑林等药物。刘道泉等[10]的试验结果表明，禽源多杀性巴氏杆菌质粒的耐药性可能与多黏菌素、利福平和左氧氟沙星的耐药有关。于成接等[11]对分离出的一株A型巴氏杆菌进行药敏实验，结果表明该菌株对痢特灵、氧氟沙星等药物敏感，选用此种药物治疗效果较好。但多杀性巴氏杆菌的耐药性受菌株的血清型、所携带的质粒、环境等多种因素影响，所以当发生巴氏杆菌病时，有必要进行耐药性分析，更合理、有效、安全的控制疫情。

表1 分离菌株的生化实验结果

表2 药敏试验结果 mm

根据流行病调查、临床症状、剖检病理变化、实验室检查，确诊该厂爆发鸽巴氏杆菌病(鸽霍乱)。为更好防控该病的发生，对分离出的菌株进行了药敏试验，分析比较该菌株对各种常用药物的敏感性，筛选出对该菌株所引起的鸽巴氏杆菌病最有治疗效果的药物。药敏结果显示证明：阿米卡星、庆大霉素等药物对该菌株具有较强的抑制作用。鸽场选用上述药物治疗该次鸽群的巴氏杆菌病，取得了良好的临床治疗效果。

多杀性巴氏杆菌为条件性传染病，一般不引起疾病，饲养管理不当、应激因素过多等因素导致鸽子抵抗力下降，会引起鸽巴氏杆菌病的爆发[12]。因此防治该类病害要采用综合防控措施：平时要加强饲养管理，提高饲料营养质量，改善鸽舍饲养环境；其次，每天定时检查鸽群，及时发现病鸽，立即采取隔离措施，清除舍内粪便及剩余饲料，保持鸽舍干燥、清洁卫生。每日可使用灭菌净、百毒杀等消毒剂，对鸽舍、鸽群及日常用具进行喷雾消毒。最后要严格控制人员进出，引进新鸽时应先隔离观察再行正常饲喂。