β-榄香烯对高糖环境下人视网膜色素上皮细胞活力及血管内皮生长因子蛋白表达的影响▲

周 赟 陈 俊 李丽华 孙一洲 陈 蕾

(中国医科大学附属第一医院眼科，辽宁省沈阳市 110001，电子邮箱：zhyun929@163.com)

β-榄香烯是一种二类非细胞毒性的抗肿瘤药，从中草药香茅草中提取而得，毒副作用轻且抗肿瘤谱广，广泛应用于肺癌、消化道肿瘤及其他浅表性肿瘤的治疗[1-2]。研究证实，β-榄香烯可以通过两种途径抑制肿瘤细胞增殖：一是通过上调凋亡相关蛋白的表达，诱导肿瘤细胞发生凋亡[3-4]，二是通过抑制肿瘤细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的生成，从而抑制肿瘤细胞生长转移[5]。许多血管性眼科疾病的视网膜中VEGF表达显著提高[6]，因此β-榄香烯是否可应用于眼科领域疾病的治疗成为研究热点。耿金等[7]的研究结果显示，β-榄香烯注射乳可以抑制氧诱导的新生血管模型小鼠视网膜新生血管的发生和发展。而β-榄香烯注射乳对糖尿病视网膜病变的治疗效果及其对高糖环境下人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的作用鲜见研究报告。本研究将不同浓度的β-榄香烯作用于高糖环境下体外培养的人RPE细胞，分析β-榄香烯对高糖环境下人RPE细胞活力及VEGF表达的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料及试剂 人RPE细胞株ARPE-19(ATCC公司，批号：AC337713)，β-榄香烯(大连远大生物集团)，杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；海克隆公司，批号：SH30022.01B)，胎牛血清(海克隆公司，批号：SV30087.02)，胰蛋白酶(海克隆公司，批号：SH30042.01B)，MTS溶液(美国Promega公司，批号：CTB169)，人VEGF酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒(达优公司，批号：CT579-10)，细胞培养板、培养瓶(康宁公司)。

1.2 细胞培养 取人RPE细胞株ARPE-19、在37℃、5% CO2的培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行贴壁培养，用2.5 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化传代，消化时间为2 min。

1.3 MTS法检测细胞活力 取对数生长期ARPE-19细胞，采用胰蛋白酶进行消化后制成单细胞悬液，以2×104个/mL的细胞密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL，将96孔板置于37℃、5% CO2培养箱内培养过夜使细胞贴壁后，将细胞分为(1)对照组：用含10%胎牛血清的低糖(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)DMEM培养基培养ARPE-19细胞；(2)高渗组：用加入27.5 mmol/L甘露醇的低糖(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)DMEM培养基培养ARPE-19细胞；(3)高糖组：用含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖浓度为33 mmol/L)DMEM培养基培养ARPE-19细胞；(4)高糖+不同浓度β-榄香烯组：分别向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖浓度为33 mmol/L) DMEM培养基中加入不同浓度β-榄香烯，β-榄香烯浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL，分别记为高糖+10 μg/mL β-榄香烯组、高糖+20 μg/mL β-榄香烯组、高糖+40 μg/mL β-榄香烯组、高糖+80 μg/mL β-榄香烯组、高糖+160 μg/mL β-榄香烯组。每组设置5个复孔，实验孔周围加入无菌磷酸缓冲盐溶液以减少样品蒸发；给予相应干预后将细胞置于37℃、5% CO2培养箱内分别干预12 h、24 h、36 h、48 h后小心吸去上清，在电镜下观察细胞密度和形态，并且选取培养时间为24 h的ARPE-19细胞拍照留存。观察细胞形态后每孔加入20 μL MTS溶液，继续置于37℃、5% CO2培养箱内培养3 h，采用酶联免疫检测仪(博科生物，型号：BIOBASE4001)检测各孔490 nm波长处的吸光度值。实验重复3次。

1.4 ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF蛋白含量 取对数生长期ARPE-19细胞，以5×105个/孔细胞密度接种于6孔培养板中(培养板每孔放入预先灭菌处理的盖玻片)，每孔2.5 mL。将6孔板置于37℃、5% CO2培养箱内培养过夜使细胞贴壁后，将细胞分为(1)对照组：用含10%胎牛血清的低糖(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)DMEM培养基培养ARPE-19细胞；(2)高糖组：用含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖浓度为33 mmol/L)DMEM培养基培养ARPE-19细胞；(3)高糖+20 μg/mL β-榄香烯组：向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖浓度为33 mmol/L)DMEM培养基中加入20 μg/mL β-榄香烯；(4)高糖+40 μg/mL β-榄香烯组：向含10%胎牛血清的高糖(葡萄糖浓度为33 mmol/L)DMEM培养基中加入40 μg/mL β-榄香烯。给予相应干预后将细胞置于37℃、5% CO2培养箱内分别培养24 h和48 h，收集细胞培养上清液，置于-80℃冰箱内冻存备用。采用ELISA法测细胞培养上清液中VEGF蛋白含量，按照试剂盒说明书进行操作。于酶标仪450 nm波长处读取吸光度值，并在标准曲线上查出样本的VEGF水平对应值,实验重复6次。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。满足正态分布的计量资料以(x±s)表示，组内比较采用配对t检验，方差不齐时比较采用非参数检验，重复测量计量资料的比较采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组ARPE-19细胞的镜下形态变化 镜下可见，对照组ARPE-19细胞以长梭形或三角形为主，胞体不透明，细胞排列紧密； 高渗组ARPE-19细胞形态和对照组类似；高糖组ARPE-19细胞排列稀疏，胞体变薄，胞内空泡变多，不规则细胞增多，形态表现多样；高糖+10 μg/mL β-榄香烯组、高糖+20 μg/mL β-榄香烯组、高糖+40 μg/mL β-榄香烯组的ARPE-19细胞形态明显优于高糖组，排列较高糖组紧密，细胞形态为梭形；高糖+80 μg/mL β-榄香烯组 ARPE-19细胞形态与高糖组类似；高糖+160 μg/mL β-榄香烯组ARPE-19细胞明显肿胀变形，空泡增多，排列稀疏。见图1。

对照组 高渗组 高糖组 高糖+10 μg/mL β-榄香烯组

2.2 β-榄香烯对高糖环境下ARPE-19细胞活力的影响 8组ARPE细胞活力吸光度值比较，差异有统计学意义(F组间=15.990，P组间<0.001)，均有随时间变化的趋势(F时间=159.870，P时间<0.001),分组与时间存在交互效应(F交互=2.520，P交互=0.003)。其中在作用12 h、24 h、36 h、48 h时，高糖组ARPE细胞活力吸光度值较对照组下降(P<0.05)；在作用24 h、36 h、48 h时，高糖+10 μg/mLβ-榄香烯组、高糖+20 μg/mL β-榄香烯组、高糖+40 μg/mL β-榄香烯组、高糖+80 μg/mL β-榄香烯组ARPE细胞活力吸光度值较高糖组升高(P<0.05)。见表1。我们发现作用时间为24 h，β-榄香烯作用浓度为20 μg/mL时ARPE细胞的吸光度值大于其他组细胞(P<0.05)，因此后续ELISA检测选定的β-榄香烯作用时间为24 h和48 h，作用浓度为20 μg/mL、40 μg/mL。

表1 各时间点8组ARPE细胞活力吸光度值(x±s)

2.3 β-榄香烯对高糖环境下ARPE细胞培养上清液中VEGF蛋白表达的影响 在作用24 h、48 h时，4组ARPE细胞培养上清液中VEGF蛋白表达比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖组、高糖+20 μg/mL β-榄香烯组、对照组、高糖+40 μg/mL β-榄香烯组ARPE细胞培养上清液中VEGF蛋白表达水平依次降低(均P<0.05)。见表2。各组作用48 h时ARPE细胞培养上清液中VEGF蛋白表达量均高于作用24 h的表达量(均P<0.05)。

表2 各组ARPE细胞培养上清液中VEGF蛋白相对表达量的比较(x±s)

3 讨 论

随着人们生活方式的改变和社会经济的高速发展，近年来糖尿病的发病率和患病率呈持续增长趋势[8]。众所周知，糖尿病以及随之而来的各种并发症严重危害人类健康，其中，糖尿病性视网膜病变是糖尿病最常见且最严重的慢性微血管并发症之一，每年因其导致失明的患者超过10 000例[9]。糖尿病性视网膜病变的基本病理改变是血-视网膜屏障破坏、新生血管和纤维增殖膜的生成，其进一步发展可引起玻璃体积血和牵拉性视网膜脱离，严重影响视力，甚至导致失明，而干预视网膜新生血管的发生和发展是目前临床面临的难题。VEGF是目前发现的作用最强的眼部新生血管形成促进因子[10]，在糖尿病性视网膜病变的发生和发展中起着非常重要的作用。在长期的高糖刺激下，视网膜各层的细胞结构和功能产生一系列的病理生理改变，其中RPE细胞是病变的中心环节之一，与糖尿病视网膜病变的发生和发展，以及新生血管生成、纤维增殖膜的形成密切相关[11]。RPE细胞层处于富含血管的脉络膜以及视网膜神经上皮层之间，是视网膜的外屏障，其所含有大量的葡萄糖载体可运送葡萄糖至视网膜外层，满足视细胞高代谢活动对能量的需求，同时血糖波动对其影响较大[12]。所以，深入了解RPE细胞在病理情况下的异常生物学行为可为糖尿病视网膜病变的发病机制、预防和治疗的研究奠定理论基础[13]。

目前在临床中，已有几种抗VEGF药物得到了广泛应用，但由于费用昂贵，许多患者无法承受长期抗VEGF治疗。有研究显示，藏药小檗皮对糖尿病大鼠视网膜具有保护作用，机制与其抑制VEGF的表达有关[14]。β-榄香烯是一种二类非细胞毒性的抗肿瘤药，从中草药香茅草中提取而得，价格相对低廉、毒副作用轻且抗肿瘤谱广。研究显示，β-榄香烯可下调人涎腺腺样囊腺癌、肺腺癌及喉鳞癌细胞中VEGF及其受体的表达水平，故推断β-榄香烯可能通过抑制VEGF的表达从而抑制肿瘤局部血管生成[15-16]。李悦等[17]的研究证实，β-榄香烯可以直接抑制血管内皮细胞的增殖以及阻断细胞周期，降低细胞的生成血管能力。还有研究表明，β-榄香烯可以和放疗协同抑制VEGF的表达，从而改善肿瘤的新生血管形成情况，并增强肿瘤细胞的放射敏感性[18]。 另外，颜兵等[19]通过体内、体外实验发现，β-榄香烯可通过抑制VEGF及VEGF受体3的表达降低淋巴管密度，且具有剂量依赖性，这可能是其防止胃癌淋巴转移的机制之一。Chen等[5]的实验研究证实，β-榄香烯通过抑制VEGF的表达，从而发挥抑制黑色素瘤生长转移的作用。而在眼科研究领域中，赵婉君等[20]发现β-榄香烯通过促进微小RNA-27a的表达和抑制VEGF的表达，对氧诱导视网膜新生血管模型小鼠的视网膜发挥抑制新生血管形成的作用。故笔者猜测β-榄香烯在糖尿病视网膜病变中也具有抑制新生血管形成的作用。鉴于VEGF是作用最强的眼部新生血管形成促进因子，且本课题组前期研究已证实β-榄香烯可以抑制糖尿病大鼠视网膜中VEGF蛋白和mRNA的表达[21]，因此本研究选取人RPE细胞，经高糖处理后加入β-榄香烯，检测细胞培养上清液中VEGF蛋白的表达情况。

本研究结果显示，在作用12 h、24 h、36 h、48 h时，高糖组人RPE细胞吸光度值较对照组下降(P<0.05)，但高渗组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；在作用24 h、36 h、48 h时，高糖+10 μg/mL β-榄香烯组、高糖+20 μg/mL β-榄香烯组、高糖+40 μg/mL β-榄香烯组人RPE细胞吸光度值较高糖组升高(P<0.05)。这提示高渗对RPE细胞活力影响不大，但高糖可显著降低细胞活力，而采用β-榄香烯进行干预可以提高细胞活力。我们发现作用时间为24 h，β-榄香烯作用浓度为20 μg/mL时人RPE细胞的活力大于其他组，因此后续ELISA检测选定的β-榄香烯作用时间为24 h和48 h，作用浓度为20 μg/mL、40 μg/mL。ELISA检测结果显示，各组作用48 h时人RPE细胞培养上清液中VEGF蛋白表达水平均高于作用24 h(P<0.05)；作用24 h、48 h时，高糖组、高糖+20 μg/mL β-榄香烯组、对照组、高糖+40 μg/mL β-榄香烯组人RPE细胞培养上清液中VEGF蛋白表达依次降低(P<0.05)。这说明随着作用时间的延长及作用浓度的增加，β-榄香烯对高糖环境下分泌型VEGF蛋白抑制作用逐渐增强。所以我们推测β-榄香烯在一定浓度范围内可改善高糖环境下人RPE细胞的活力，并且降低人RPE细胞培养上清液中VEGF蛋白的表达，且存在一定的时效关系及量效关系。

综上所述，一定浓度的β-榄香烯可改善高糖环境下人RPE细胞的活力，并且降低VEGF蛋白的表达，但其中的作用机制还有待进一步研究。