钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ在脂多糖诱导的脓毒症致急性呼吸窘迫综合征膈肌功能障碍中的作用

钟小妹 尹辉明 周康仕 邱飞 高丹 雷建明

湖南医药学院第一附属医院呼吸科（湖南怀化418000）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distresssyndrome，ARDS）是由多种病因引起的一种综合征，主要表现为进行性呼吸衰竭，临床死亡率高达30%～60%［1-2］。脓毒症、肺炎、创伤等多种病因均可引起ARDS，其中脓毒症占40%，是ARDS 最常见的病因［3］。研究表明，脓毒症可导致膈肌功能障碍出现收缩力下降［4-5］。

钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ（Calcium∕calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）是一种分布广泛的丝氨酸∕苏氨酸蛋白激酶，存在于多种动物的细胞内，其中神经组织中含量最为丰富，是目前为止研究比较广泛且功能最多的一种钙调蛋白依赖性激酶，其生物学多样且机制复杂［6］。脊柱动物的CaMKⅡ基因型非常保守，具有2a、2b、2d、2g四种基因型，其中2a 亚型仅在神经组织中表达［7］，2b、2d、2g 则在骨骼肌、心肌等组织中均有表达［8］。CaMKⅡ是钙离子调节蛋白及转录反应的重要效应器，其可通过激活一些靶蛋白、转录因子等，从而介导细胞的萎缩、凋亡等多种生物过程［9-10］。

目前研究表明，CaMKⅡ在脓毒症导致的骨骼肌功能障碍中表达是下调的［11］，其可能通过介导炎症反应导致骨骼肌损伤，最终出现功能障碍［12］。同时，也有研究表明，CaMKⅡ的高表达在心肌功能障碍中占有重要作用［13］。因此，就目前研究来说，对于CaMKⅡ在心肌及骨骼肌中的表达仍存在争议。膈肌作为一种特殊类型的骨骼肌，同样有着收缩功能，为呼吸提供主要动力，占总动力的60% ～80%［14］，在正常及心衰时维持一定的呼吸功能均占有非常重要的作用［15-16］。

目前对于CaMKⅡ在膈肌中有表达鲜有报道，且对于其在ARDS 导致的膈肌功能障碍中的研究则更少。因此，对CaMKⅡ在ARDS 导致膈肌功能障碍中的研究具有非常重要的意义。

本研究通过构建大鼠ARDS 致膈肌功能障碍模型，研究CaMKⅡ基因在膈肌组织中的表达，并通过建立不同时间梯度的ARDS 动物模型，对正常组CaMKⅡ不同亚型表达情况及ARDS 组表达的分析，为脓毒症诱导ARDS 膈肌功能障碍致呼吸衰竭的治疗提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要设备和试剂主要实验设备：XP基因扩增仪（TC-XP-E），实时荧光定量PCR 仪（ABI 7500）。微量紫外分析仪（NANO DROP 2000）。主要实验试剂：脂多糖（Lipopolysaccharides LPS Sigma 公司，032M4082V），异丙醇，固相RNA 酶清除剂（湖南医药学院基础实验室），氯仿，10%水合氯醛，Trison（TaKaRa 公司，Code No. 9108∕9109），细胞分散器（IKA T10 basic，ULTRA-TURRAX），逆转录试剂盒（TaKaRa 公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A），PCR 试 剂 盒（TaKaRa 公司，SYBR®Premix Ex TaqTMII，RR820A）；

1.2 动物健康成年SD（Sprague-Dawley）32 只（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），雄性，月龄（2 个月± 1 周），体质量（250 ± 20）g。将SD大鼠随机分成对照组和ARDS 实验组，并将ARDS实验组进一步随机分为ARDS 24 h 组、48 h 组及7 d 组。

1.3 实验方法

1.3.1 制备动物模型随机分组后，对照组腹腔注射生理盐水（10 mL∕d），ARDS 24 h 组腹腔注射LPS 8 mg∕（kg·d），观察24 h；ARDS 48 h 组先注射一次LPS 8 mg∕（kg·d），24 h 后再次注射LPS，持续观察48 h；ARDS 7 d 组先注射一次LPS 8 mg∕（kg·d），24 h 后再次注射LPS，持续观察7 d。观察内容包括大鼠的生命体征、体质量、进食、活动。

1.3.2 获取标本结束观察后，将大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，取出膈肌组织，分装至EP管（50 ～100 mg∕管），用液氮转入-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 提取RNA取出标本，冰上操作，剪碎组织，匀浆，离心分层数次，弃上清，取得RNA。用微量紫外分析仪对RNA 浓度及纯度进行测定，选用纯度为2.0 ～2.1 的RNA。

1.3.4 Real-time PCR从GenBank 查 出SD 大 鼠β-actin 和CaMKⅡ三种基因型的基因mRNA 序列，利用Primer-BLSAT设计专一引物，并由上海生工生物工程公司合成。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒说明进行逆转录，得20 μL cDNA，稀释1倍，按SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明扩增，扩增反应条件：95 ℃5 min；循环时95 ℃30 s、56 ℃60 s、72 ℃20 s 共40 个循环。扩增过程中观察记录荧光曲线及溶解曲线。

1.4 统计学方法以均数±标准差表示各组数据，通过SPSS 25 软件对各组数据进行统计与分析。采用单因素方差分析的方法对CaMKⅡ各亚型mRNA的表达进行分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ2b、2d、2g 在正常组织中mRNA 的Ct 值CaMKⅡ2b、2d、2g 在正常膈肌中均有表达，其中2b 表达最少，差异有统计学意义，见表1。

表1 各组CaMKII 3 亚型的Ct 值Tab.1 Ct value of CaMKII 3 subtype in each group ±s

表1 各组CaMKII 3 亚型的Ct 值Tab.1 Ct value of CaMKII 3 subtype in each group ±s

组别（n=8）Ct Normal 2b Normal 2d Normal 2g 33.11±0.72*28.57±0.58 27.69±0.59

2.2 钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ2b、2d、2g 在对照组及脓毒症致急性呼吸窘迫综合征不同时间（24、48 h、7 d）组中的mRNA 相对表达量CaMKⅡ2b、2d、2g 三种亚型在ARDS 组（24、48 h、7 d）中表达均比对照组高，且同时均在ARDS 48 h 组表达最高，差异有统计学意义（P＜0.05）。ARDS 48 h组内三种亚型进行比较，其中CaMKⅡ2b 亚型表达水平较CaMKⅡ2d、2g 明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

ARDS 病死率高，临床治疗效果差，且目前尚无有效治疗靶点。膈肌不同于骨骼肌及心肌，且目前对于CaMKⅡ在膈肌中的表达情况，及其在LPS 诱导的ARDS 导致膈肌功能障碍中的研究尚不清楚。

表2 各组camki2b、2d、2 g mRNA 的表达水平Tab.2 The expression level of CaMKII 2b、2d、2g mRNA in each group ±s

表2 各组camki2b、2d、2 g mRNA 的表达水平Tab.2 The expression level of CaMKII 2b、2d、2g mRNA in each group ±s

注：与ARDS 组比较，*P ＜0.05；与ARDS 24 h、7 d 组比较，#P ＜0.05；（ARDS 48 h 组中）与CaMKII2d、2g 亚型比较，△P ＜0.05

CaMKII 2b mRNA（AU）CaMKII 2d mRNA（AU）CaMKII 2g mRNA（AU）1*1*1*组别（n=8）对照组ARDS 24 h ARDS 48 h ARDS 7 d 4.94±1.08 15.07±5.02#△4.18±1.23 2.23±0.44 4.43±1.96#2.11±0.49 2.06±0.38 3.65±1.54#2.04±0.72

研究表明，CaMKⅡ的过量表达在心肌功能障碍中占有重要作用［17］，其可能通过介导炎症反应、细胞内钙离子水平从而影响肌肉兴奋收缩偶连、调节细胞程序性死亡等参与心肌收缩力下降［18］，而抑制CaMKⅡ的表达则可抑制心肌凋亡，从而进一步改善心脏功能，达到保护心脏的作用［19］。同时CaMKⅡ还可以通过参与介导细胞自噬调节心肌肥大最终导致心脏功能障碍的发生［20］。

本研究表明，CaMKⅡ不同亚型2b、2d、2g 在正常膈肌组织中均有表达，其中2b 表达最少。ARDS各组膈肌细胞内CaMKⅡ的不同亚型（2b 2d 2g）mRNA 表达水平均比对照组显著上调，表明CaMKⅡ参与了LPS 诱导ARDS 导致的膈肌功能障碍。我们前期研究表明，作为CaMKⅡ的上游调节因子-钙调蛋白（camodulin，CaM）的高表达在脓毒症致ARDS 导致膈肌功能障碍中占有重要作用［21］。因此推测脓毒症致ARDS 时，导致上游因子CaM 表达增高，其作为细胞内最主要的Ca2+结合蛋白，通过与Ca2+结合后形成Ca2+-CaM 复合物，从而激活CaMKⅡ使其表达上调，最终再进一步通过激活下游因子如血清应答因子（surum factor）等最终导致肌肉收缩功能障碍［22］。本研究表明在ARDS 导致膈肌功能障碍的大鼠模型中，CaMKⅡ2b、2d、2g均在ARDS 48 h 组中表达最高，且2b 亚型较2d、2g表达水平明显升高，但正常膈肌组织中CaMKⅡ2b 亚型表达最少。结合笔者前期的研究，膈肌在ARDS 48 h 组损伤最重［23］，因此，在膈肌损伤最重时，CaMKⅡ三种亚型表达均显著升高，进一步表明其参与LPS 诱导的ARDS 致膈肌功能障碍。同时，CaMKⅡ2b 亚型在正常膈肌组织中表达最少，但是在膈肌损伤最重时（ARDS 48 h 组）表达水平却最高，推测其可能是导致膈肌功能障碍最主要的基因型。因此，当脓毒症发生时，膈肌组织通过上调CaM 的表达从而激活下游CaMKⅡ2b，使其表达上调，并进一步激活下游因子如血清应答因子（serum response factor，SRF）等，从而导致膈肌功能障碍［24］或通过介导细胞内炎症反应、调节细胞内钙离子水平、细胞程序性死亡等过程导致肌肉功能障碍。

本研究首次在膈肌中发现了CaMKⅡ的表达，明确其在脓毒症诱导的ARDS 导致膈肌功能障碍中的作用，探索了其作用机制。理论上可以通过靶向性抑制CaMKⅡ2b 亚型的表达，从而改善膈肌功能，增加膈肌收缩力，最终改善呼吸衰竭情况，为临床ARDS 导致呼吸衰竭的治疗提供实验基础和理论依据。

但本研究仍存在一些不足，缺乏对下游信号因子基因及蛋白水平的进一步研究，从而导致信号通路研究的不完整性。关于这些不足，一方面，目前正在对其下游因子，血浆应答因子等的表达进行研究，在蛋白水平、基因水平、酶活性等方面对该通路进行进一步探索，进一步更全面诠释该通路在ARDS 导致膈肌功能障碍中的作用。另一方面，同时在对CaMKⅡ其介导的炎症因子通路、及细胞死亡等信号通路进行研究，从而进一步明确CaMKⅡ在ARDS 导致膈肌功能障碍中作用的研究。