姜黄素对肺癌相关LncRNA表达及厄洛替尼敏感性的影响

徐亚莉，曹晓静，朱小珍，朱光辉

温州医科大学附属第二医院 药学部，浙江 温州 325027

肺癌是全世界范围内发病率及病死率均居首位的恶性肿瘤，且呈现出快速增长的趋势[1]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变是导致肺癌发生发展最主要的原因之一，其持续活化将导致下游多种原癌基因网络的激活[2]。EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）可显著抑制EGFR活性，阻止下游信号的转导，其成员厄洛替尼是目前晚期肺腺癌患者的一线用药[3]，但获得性耐药的发生极大地限制了其临床疗效[4]，因此，明确影响EGFR-TKI类药物抵抗发生的关键因素成为亟待解决的问题。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）作为机体重要的表观遗传调控分子群，参与影响细胞EGFR-TKI的敏感性[5]。近年有研究指出，姜黄素在EGFR-TKI类药物治疗肺癌的过程中可能发挥着积极作用[6]，但具体机制仍需进一步明确。本研究以EGFR敏感性突变的肺癌细胞株PC9为体外模型，探究姜黄素对肺癌相关LncRNA表达的影响及其与细胞TKI药物敏感性的关系。

1 材料和方法

1.1 细胞分组 实验细胞包括非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）EGFR突变PC9细胞株（PC9 WT）和PC9厄洛替尼抵抗细胞株（PC9 ER）。培养环境：5% CO2，37 ℃，湿度100%。

细胞分组：将PC9 WT细胞分为对照组及实验组，将PC9 ER细胞分为抵抗组及处理组。在450 mL RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）中加入10%胎牛血清（50 mL，美国Gibco公司）及10 μmoL姜黄素（美国Sigma-Aldrich公司）或等体积0.9%氯化钠溶液作为细胞培养液备用，实验组及处理组采用含20 μmol·L-1姜黄素（美国Sigma-Aldrich公司）的RPMI-1640培养液（美国Gibco公司）培养，对照组及抵抗组采用含等体积0.9%氯化钠溶液的RPMI-1640培养液培养，培养时长72 h[7]。

1.2 实时荧光定量PCR（qPCR）实验 设计并合成LncRNA MALAT1、LSINCT5、UCA1、HOTAIR、GAS5及H19的qPCR引物（上海生工生物工程公司），引物序列如表1所示。各组细胞培养于6孔板中，待细胞融合度＞80%，TRIzoL（日本Takara公司）抽提细胞总RNA，30～50 μL无核酶水稀释（美国Invitrogen公司），Nanodrop2000（美国Thermo公司）检测总RNA浓度，均取1 μg进行反转录，反应条件根据试剂盒（美国Promega公司）进行设置，FastStart Universal SYBR Green（美国Roche公司）核酸荧光染料检测各组细胞中待测LncRNA的CT值，以β-actin为内参基因，ABI7500实时荧光定量PCR系统（美国Applied Biosystems公司）进行荧光信号累积分析，采用2-△△CT法计算各LncRNA的表达水平。

表1 引物序列

1.3 CCK-8实验 在10 cm培养皿中培养各组细胞，消化离心后进行细胞计数，以1×103个/孔接种至96孔板中，设置6个厄洛替尼浓度梯度，分别为0、0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol·L-1，同时每组细胞每个浓度梯度设置5个重复孔，接种细胞后24 h采用梯度浓度厄洛替尼处理细胞24 h，4 ℃取出CCK-8试剂与RPMI-1640+10% FBS培养液1:9混合均匀，替代含厄洛替尼的培养基，5% CO2，37 ℃避光孵育2 h，多孔酶标仪（美国Bio-Rad）检测细胞450 nm处OD值，空白孔调零，以各组细胞0 μmol·L-1厄洛替尼处理下的相对OD值作为100%参照，计算不同浓度下各细胞系相对细胞活力的百分数。

1.4 统计学处理方法 SPSS18.0软件进行统计学分析。计量资料以±s 表示，多组间比较采用方差分析，SNK-q 检验进行组间两两比较，厄洛替尼半数抑制浓度（semi-inhibitory concentrations，IC50）以细胞各浓度梯度的相对细胞活力绘制拟合曲线来计算。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞肺癌相关LncRNA的表达比较 相比对照组，实验组MALAT1、LSINCT5、HOTAIR及H19表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），UCA1及GAS5的表达差异无统计学意义（P＞0.05），而抵抗组及处理组各LncRNA均显著增高（P＜0.05）；相比抵抗组，处理组LncRNA MALAT1、LSINCT5、HOTAIR、GAS5及H19表达均显著降低（P＜0.05）。见表2。

2.2 对照组及实验组细胞厄洛替尼IC50比较 对照组及实验组细胞以0 μmol·L-1厄洛替尼处理下的相对OD值作为存活率100%，绘制0、0.01、0.1、1、10、100及1 000 μmol·L-1浓度下，以细胞存活率为纵坐标的拟合曲线，通过拟合曲线计算生成相应的厄洛替尼IC50，结果显示，对照组、实验组、抵抗组及处理组细胞厄洛替尼IC50分别为0.416±0.030、0.375±0.058、8.159±0.602、3.167±0.283 μmol·L-1，相比对照组，实验组厄洛替尼IC50 差异无统计学意义（P＞0.05），而抵抗组及处理组IC50均显著增高（P＜0.05）；相比抵抗组，处理细胞IC50显著降低（P＜0.05）。见图1。

表2 各组细胞中肺癌相关LncRNA的表达比较

图1 不同浓度厄洛替尼对细胞存活率影响的拟合曲线

3 讨论

肺癌是导致癌症相关死亡的主要原因，多数肺癌患者初诊时已处于中晚期，导致患者5年生存率低至4%～17%[8]，靶向药物的开发显著延长了患者的总体生存时间，但绝大多数仍在8～12个月时发生耐药[9]。姜黄素是一种存在于植物组织中的二酮类化合物，作为天然色素被广泛应用于食品及医药行业，而其药用价值包括降低血脂、抑制炎症、对抗氧化应激及抑制肿瘤等[10]。体内外实验显示，姜黄素可在多水平、多角度抑制肺癌的发生发展：姜黄素通过下调Wnt/β-catenin通路活性，抑制肺癌的干细胞表型[11]，并可优先促进肿瘤细胞中活性氧产物的生成，通过STAT3途径介导肺腺癌细胞及相应顺铂耐药细胞的凋亡[12-13]；姜黄素还可通过RAC1依赖途径及PI3K/Akt通路抑制肺癌细胞的增殖及转移[14-15]。近年有研究指出，姜黄素对肺癌细胞具有潜在的EGFR-TKI增敏作用：CHEN等[6]发现姜黄素可通过诱导细胞自噬，克服肺癌细胞对吉非替尼的原发性耐药；DAI等[16]及LI等[17]研究显示姜黄素类似物可下调肺癌细胞EGFR表达并抑制其磷酸化，增加厄洛替尼对其耐药细胞的敏感性，同时介导厄洛替尼耐药细胞的凋亡。

LncRNAs作为机体内重要的表观调控分子，同样被发现参与肺癌细胞EGFR-TKI抵抗的形成，包括LncRNA MALAT1、UCA1、HOTAIR、GAS5及H19可通过多种途径影响肺癌细胞对EGFR-TKI的敏感性[18-22]，而姜黄素也对多种LncRNA存在调控作用，包括PVT1、lincROR及MEG3等[23-25]，提示姜黄素可能通过影响LncRNA的表达，发挥肺癌细胞EGFR-TKI的增敏作用。

本研究通过文献检索，选取与肺癌细胞EGFRTKI敏感性有关的LncRNA，包括MALAT1、UCA1、HOTAIR、GAS5及H19作为研究对象，同时，通过生物信息学网站（http://annolnc.cbi.pku.edu.cn/）分析发现LSINCT5[26]作为EGFR潜在的调控分子，可能在肺癌细胞EGFR-TKI抵抗的形成中发挥作用，也作为本研究的检测对象。本研究结果显示，姜黄素可显著下调PC9亲本细胞中LncRNA MALAT1、LSINCT5、HOTAIR及H19的表达，提示其可能对多种肺癌相关LncRNA存在广谱的转录调控作用，但对野生型PC9细胞EGFR-TKI敏感性无显著影响，推测可能由于野生型细胞中EGFR-TKI抵抗的相关通路处于未激活状态，故姜黄素对其IC50无显著影响。同时，我们在EGFR-TKI抵抗的PC9细胞中验证了MALAT1、UCA1、HOTAIR、GAS5及H19的高表达状态，并发现LSINCT5同样高表达于抵抗细胞，这表明LSINCT5也可能作为促进因子在肺癌细胞EGFR-TKI抵抗的形成中发挥作用，进而采用姜黄素处理抵抗细胞后发现，MALAT1、LSINCT5、HOTAIR、GAS5及H19表达均显著降低，同时细胞EGFR-TKI敏感性显著增高，表明姜黄素可显著抑制多种EGFR-TKI抵抗相关LncRNA的表达，并部分逆转细胞EGFR-TKI抵抗能力，值得一提的是，本研究发现LSINCT5基因表达在厄洛替尼抵抗细胞中的显著差异，且对姜黄素处理反应敏感。在接下来的研究中，我们将通过体外细胞实验及分子生物技术等手段，阐明姜黄素对多种LncRNA的调控机制，并明确LSINCT5与肺癌EGFR-TKI敏感性的确切关系，为相关辅助药物及联用靶向药物的开发提供新的依据。