加味复方三棱丸对大鼠子宫内膜异位症血管生成及其侵袭性的影响*

叶兰，陈怡，何正光，陈刚，徐晓玉**

(1.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025；2.西南大学 药学院，重庆 400715；3.重庆师范大学医院 药剂科，重庆 400047；4.重庆工商大学药物研究中心，重庆 400067)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是一种女性常见疾病[1]，研究表明免疫机制和血管新生可能在EMS的发生和发展中有着重要作用[2]。血管内皮细胞在异位组织上侵袭性生长时可以释放细胞因子、蛋白水解酶等物质，可增加内膜细胞的侵袭能力，同时促进异位组织的增殖[3]。三棱丸由三棱和莪术两味中药组成，有调控血管新生、改善瘀血经闭的功效[4-5]。三七具有抗炎作用[6-7]。尚未见上述主成分合用于治疗EMS。基于此，本研究分别选取三棱、莪术、三七的有效成分三棱酸、莪术油和三七总皂甙组成加味复方三棱丸(san-leng-wan，SLW)，拟从三棱丸抑制血管新生及侵袭性的角度探讨其治疗EMS的疗效及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物与主要试剂 三棱酸(广西昌洲天然产物开发有限公司)、莪术油软胶囊(浙江维康药业有限公司，国药准字Z20054256)、水提三七总皂甙(云南红云生物工程技术有限公司，国食健字G20040597)以及孕三烯酮胶囊(北京紫林药业有限公司，国药准字H19980020)，ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程公司)、总RNA提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，抗鼠基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体、基质金属蛋白酶抑制-1(TIMP-1)抗体(Santa Cruz公司)，免疫组化SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，MMP-9、TIMP-1、β-actin引物(英骏生物技术有限公司)。

1.1.2动物 清洁级SD大鼠61只，均为雌性，体质量(200±20)g，购于重庆医科大学实验动物中心，动物使用许可证SYXK(渝)20020007，动物生产合格证SCXK(渝)20020003。

1.2 方法

1.2.1制作大鼠EMS模型[8]通过阴道脱落细胞涂片判定大鼠性周期，选择在大鼠动情期进行手术制作EMS模型。5%水合氯醛以0.07 mL/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，常规消毒铺巾，切开下腹部暴露子宫，分离右侧子宫后切除约1 cm长的子宫段，剪成约5 mm×5 mm的子宫组织(包括肌层)，选取两块子宫内膜组织，以浆膜面朝向腹膜及黏膜面朝向腹腔用线固定四角于左侧腹壁肌肉，然后关腹。

1.2.2模型大鼠异位组织检测[8]手术后第4周切开造模大鼠下腹部观察，异位移植物体积增大伴有液体积聚，可见异位组织有隆起透亮的小囊状结缔组织或大网膜覆盖，并有血管形成，测量异位组织的体积，切取移植物送检，证实移植物中有子宫内膜上皮细胞、腺体及间质的生长。将符合上述观察结果，且异位组织体积≥8 mm3的动物作为子宫EMS大鼠模型，纳入后续实验。

1.2.3分组处理 选取EMS模型大鼠40只随机均分为5组，包括模型组、孕三烯酮组[0.5mg/(kg·d)]、SLW(高、中、低)剂量组 [分别为最佳剂量的3、1、1/3倍，最佳剂量在课题组前期经过正交试验确定为0.50 g/(kg·d)三棱酸+1.00 g/(kg·d)莪术油+0.02 g/(kg·d)三七总皂甙]，另取8只正常大鼠作为正常组。SLW各剂量组和孕三烯酮组每天灌胃给药1次，连续给药28 d。正常组及模型组每天以等容积的生理盐水灌胃，连续灌胃28 d。

1.3 观察指标

1.3.1腹腔液中血管内皮生长因子(VEGF)含量 造模、灌胃28 d后，禁食12 h，抽取各组大鼠腹腔液1 mL，离心1 000 r/min，10 min后取上清液。按照试剂盒说明书，ELISA检测腹腔液中VEGF含量。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；待测样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL；随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min；弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.3.2血清雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)含量的测定 颈动脉放血法处死各组大鼠后，取血清1 mL，采用放免法检测E2和P含量。

1.3.3取组织标本 造模、灌胃28 d后，取模型组、孕三烯酮组及SLW(高、中、低)剂量组大鼠造模部位异位组织，采用游标卡尺测量异位组织体积大小后分成两部分，一部分异位组织(50 mg)放入液氮冻存待用；另一部分异位组织置于多聚甲醛固定液固定24 h，常规包埋后连续切片，后行HE染色、免疫组化。正常组取子宫采用液氮冻存或甲醛固定，其余方法同前。

1.3.4MMP-9、TIMP-1、Ⅷ因子的表达 选取各组大鼠内膜组织空白切片，采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替Ⅰ抗作为阴性对照，抗Ⅷ因子(微血管标志物)、抗MMP-9以及抗TIMP-1 抗体作为Ⅰ抗，进行免疫组化染色，镜下观察各组切片的染色结果，图像分析系统进行分析。MMP-9与TIMP-1阳性判定标准[9]：阳性为组织腺上皮及间质细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，不出现者为阴性。镜下观察结果根据棕色反应的阳性程度及面积判断，阳性程度分为无着色(0分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)以及棕褐色(3分)，阳性面积分为无着色为0分、着色<1/3为1分、1/3～2/3为2分以及>2/3为3分。

1.3.5微血管密度(MVD)的判定[10]Ⅷ因子是微血管标志物，其免疫组化染色结果是用于MVD的判定。在低倍镜(100×)下找出各组子宫异味内膜组织中微血管最密集的部位后，在高倍镜(200×)下进行观察。采用Hawighorst 等[11]的判断标准，结果以3个200倍视野下血管数目的平均数来表示，以在内膜组织中与邻近微血管、腺体组织分界清楚的任何一个染成棕色的细胞或细胞丛均被认为是1个新生血管。

1.3.6子宫异位组织中MMP-9、TIMP-1mRNA的表达[12]采用RT-PCR法，TIMP-1引物序列上游5′-atctggcatcctcttgttgc-3′，下游5′-aagaagctgcaggcattgat-3′，扩增产物为354 bp；β-actin引物序列上游5′-agccatgtacgtagccatcc-3′，下游5′-tctcagctgtggtggtgaag-3′，扩增产物为227 bp；MMP-9引物序列上游5′-cgtcgtgatccccacttact-3′，下游5′-agagtactgcttgcccagga-3′，扩增产物为433 bp。按说明书提示条件，94 ℃预变性2 min，变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共持续40个循环。PCR产物经琼脂糖电泳后置于凝胶成像系统下成像，光密度扫描。目的扩增条带的光密度值与对照组β-actin的光密度值之比作为分析值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 模型复制结果

术后4周，异位组织外观呈隆起透亮的小包状，表面有血管生成，内部充满积液(图1)。53只大鼠中40只建模成功，成功率为75.5%(40/53)，模型大鼠均未死亡，成活率100%。

图1 子宫内膜异位症大鼠异位组织外观Fig.1 The ectopic tissues of EMS models

2.2 各组EMS大鼠异位组织体积

与模型组比较，SLW不同剂量组大鼠异位组织体积减小，SLW高、中剂量组体积减小最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组子宫内膜异位症大鼠异位组织的体积Tab.1 Effect of SLW on the heterotopic tissue volume size of EMS

2.3 正常组大鼠子宫内膜和其他组大鼠异位内膜的组织学观察

正常组大鼠，子宫内膜由内向外分别为上皮细胞层、间质细胞层及少量纤维结缔组织，囊内为少量漂浮的白细胞和黏液。模型组大鼠，异位内膜腺上皮细胞呈高柱状或矮柱状排列在囊泡内腔面，细胞核大呈椭圆形位于基底部，细胞内胞浆丰富；腺上皮细胞内膜间质丰富，可见个别部位有腺上皮层内陷形成假腺体，完整腺腔中可见分泌物存在，分泌物呈淡红色。孕三烯酮组和SLW高剂量组内膜腺上皮层可见明显变薄，腺上皮细胞呈矮柱状、排列松散、细胞核不规则，腺上皮胞浆嗜碱性增加。见图2。

图2 正常组大鼠子宫内膜和其他组大鼠异位内膜的组织学观察(HE，×40)Fig.2 Histopathological changes of endometrium in each group(HE，×40)

2.4 各组大鼠腹腔液VEGF的含量

与正常组比较，模型组大鼠VEGF增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，SLW高、中剂量组腹腔VEGF含量降低，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠腹腔液VEGF的含量Tab.2 Effect of SLW on the contents of VEGF in peritoneal fluid of EMS

2.5 各组大鼠血清E2、P水平

与正常组比较，模型组大鼠血清E2含量升高(P<0.05)；与模型组比较，SLW高、中、低剂量组大鼠血清E2含量降低(P<0.01或P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清E2、P水平Tab.3 Effect of SLW on the E2 and P concentration of serum in EMS

2.6 不同剂量SLW对EMS异位组织MMP-9、TIMP-1表达的影响

正常组子宫内膜组织MMP-9阳性染色细胞数量少，染色浅；模型组异位组织MMP-9阳性染色细胞数量多，染色呈明显黄色或棕黄色，其表达评分分值较正常组增高(P<0.05)；而SLW高、中、低剂量组MMP-9阳性细胞数量减少、染色浅，其表达评分分值较模型组降低(P<0.05)；见图3。正常组子宫内膜组织TIMP-1阳性染色细胞数量多，染色深；模型组异位组织TIMP-1阳性染色细胞数量少，胞浆染色呈淡黄色，其表达评分分值较正常组降低(P<0.05)；而SLW各剂量组异位组织中TIMP-1阳性细胞数量多且深染，其表达评分分值较模型组增高(P<0.05)；见图4。

图3 正常组大鼠子宫内膜组织和其他组大鼠异位组织中MMP-9蛋白的表达(DAB，×20)Fig.3 Immunohistochemical staining of MMP-9 expression in endometrium(DAB，×20)

图4 正常组大鼠子宫内膜组织和其他组大鼠异位组织中TIMP-1蛋白的表达(DAB，×20)Fig.4 Immunohistochemical staining of TIMP-1 expression in endometrium(DAB，×20)

2.7 不同剂量SLW对EMS大鼠子宫异位组织MVD的影响

与正常组比较，模型组大鼠子宫异位组织MVD增加(P<0.05)，提示模型组异位组织内血管较正常组子宫更密集。与模型组比较，SLW高、中剂量组大鼠子宫异位组织MVD减少(P<0.05)，提示SLW高、中剂量组大鼠血管数较模型组减少(P<0.05)。见表4、图5。

图5 正常组大鼠子宫内膜组织和其他组大鼠异位组织中Ⅷ因子的表达(DAB，×20)Fig.5 Immunohistochemical staining of factor VIII expression in endometrium(DAB，×20)

表4 正常组大鼠子宫内膜组织和其他组大鼠异位组织中MVD水平Tab.4 Effects of SLW on the MVD in the heterotopic tissues of EMS

2.8 不同剂量SLW对EMS大鼠异位组织MMP-9、TIMP-1 mRNA表达的影响

模型组大鼠异位内膜组织MMP-9 mRNA的表达较正常组增加(P<0.05)，SLW各剂量组异位内膜组织MMP-9 mRNA的表达较模型组减少(P<0.05)；模型组大鼠异位内膜组织TIMP-1 mRNA的表达较正常组减少(P<0.05)，SLW各剂量组异位内膜组织TIMP-1 mRNA的表达较模型组增加(P<0.05)。见表5、图6。

表5 正常组大鼠子宫内膜组织和其他组大鼠异位组织中MMP-9、TIMP-1mRNA的表达Tab.5 Effect of SLW on expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA in the heterotopic tissues of EMS rats

MMP-9 mRNA TIMP-1mRNA 图6 正常组大鼠子宫内膜组织和其他组大鼠异位组织中MMP-9、TIMP-1mRNA的表达(RT-PCR)Fig.6 Effect on the expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA in ectopic tissues of EMS rats(RT-PCR)

3 讨论

EMS是育龄妇女常见的疾病，其主要病理生理过程为子宫内膜碎片于经期随经血逆流，通过输卵管种植于卵巢和邻近的盆腔腹膜，随后在种植处继续生长和蔓延，导致EMS形成[13]。药物治疗一般是抑制EMS形成，多推荐长期的、可负担且副作用较小的治疗方案[14-16]。

本课题组前期研究发现，三棱莪术含药血清可以抑制VEGF蛋白和mRNA的表达，从而抑制新生血管生成[17]；三棱莪术水提液可抑制新生肉芽组织中新生血管生成，进一步证实三棱莪术可抑制VEGF蛋白和mRNA在新生血管的表达[18]。基于前期研究，本研究观察了SLW对大鼠EMS发展、血清激素水平的调节、血管生成的影响，以及异位内膜侵袭周围组织能力的影响。结果显示SLW中、高剂量组可以有效减小异位内膜的体积，降低血清E2水平、MMP-9蛋白和mRNA的表达以及VEGF含量，SLW的3个剂量组均可升高TIMP-1蛋白及mRNA的表达。

研究显示新生血管生成过程中，内皮细胞循环和血管结构形成均需要细胞外基质的降解和重建，MMP在其中起重要作用[19-20]。MMP家族中MMP-9属于IV型胶原，相对分子质量为92 000，表达在子宫内膜腺上皮细胞、巨噬细胞、基质细胞等细胞中。MMP-9能降解如IV型和V型胶原蛋白、纤维结合蛋白等细胞外基质(ECM)成分[21-22]。本实验发现，模型组异位内膜MMP-9蛋白与mRNA表达量升高，经SLW治疗4周后异位内膜体积明显缩小，病理学改变明显，血清E2含量降低，腹腔液VEGF含量降低，异位内膜MVD减少，MMP-9蛋白与mRNA表达降低，提示SLW的作用机制与削弱MMP对ECM的降解作用密切相关。

TIMP是MMP的天然抑制物。有研究显示TIMP可阻碍MMP介导的内皮细胞侵袭，并抑制基质中促血管生长因子的释放，减少ECM的降解[23]。其中TIMP-1不仅在子宫内膜基质、腺体以及腔上皮中表达，而且在血管内皮细胞中也有表达。TIMP-1可结合活化的MMP-9形成复合体从而抑制其活性。有研究显示TIMP-1能抑制血管内皮细胞出芽[24-25]。本实验中发现模型组异位内膜TIMP-1蛋白与mRNA表达量减少，而经治疗4周后，TIMP-1蛋白与mRNA表达升高，提示SLW的作用机制与增强TIMP后进一步抑制MMP介导的内皮细胞侵袭，降低ECM的降解有关，从而延缓EMS疾病的进程。

综上所述，SLW可抑制子宫内膜异位症的发生和发展，其机制可能与其抑制EMS大鼠腹腔微环境VEGF分泌，抑制异位组织血管新生及其侵袭能力相关。这将为SLW的进一步临床应用开发提供实验依据和新思路。