结肠癌组织中FAM96B和TCF4的表达及其与临床病理特征的关系*

杨道丽，成元华

(1.贵州医科大学 基础医学院 病理学教研室，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院 病理科，贵州 贵阳 550004)

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，具有高侵袭性和高死亡率的特点[1]。结肠癌在青少年群体患病率呈逐年上升趋势[2]。96序列相似的家庭成员B(family with sequence similarity 96，member B，FAM96B)基因位于人类16号染色体，包含4个外显子，编码163个氨基酸。FAM96B蛋白能与铁硫(Fe/S)辅助因子结合参与铁稳态调节，Fe/S蛋白在DNA复制、修复、染色体分离及核糖体蛋白翻译过程中起重要作用[3-4]。研究认为，FAM96B是一种新型潜在的抑癌基因，与消化道恶性肿瘤(如：胃癌及肝癌)的发生发展有关[5-6]。FAM96B蛋白能增加细胞的增殖潜能、导致细胞周期停滞、启动DNA损伤修复并维持基因组稳定性[7-8]。研究表明，FAM96B蛋白能调节T细胞因子(T cell factor 4，TCF4)的表达，进而调节血管内皮细胞的增殖及迁移形成[9]。TCF4，亦称转录因子E2-2，是Wnt信号通路的关键调节因素之一，该通路调控细胞生长及细胞周期，可诱导细胞大量增殖，最后导致肿瘤的形成[10]。失调的Wnt通路传导不仅和癌症的发生有关，而且在晚期癌症和转移患者中发挥着重要作用[11]。TCF4在调控转录过程中起着激活或抑制双重作用，可调控下游基因的表达，从而导致细胞异常增殖[12]。因此，TCF4与肿瘤的发生发展密切相关，然而，涉及调控TCF4蛋白的因子仍然知之甚少。本研究通过探究结肠癌中FAM96B和TCF4蛋白的表达情况及其与临床病理特征之间的关系，为进一步了解结肠癌的发生发展机制及探索新的治疗方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本来源 收集2018年6月—2019年1月病理科保存的手术切除的结肠癌肿瘤组织蜡块标本60例作为观察组，均经2位高年资病理医师阅片复查。60例结肠癌肿瘤组织，男性38例、女性22例，年龄26～82岁、平均(61.1±12.5)岁，据2010年第七版国际抗癌联盟结肠癌TNM分期标准Ⅰ期10例、Ⅱ期27例、Ⅲ期18例及Ⅳ期5例，采用2010年WHO消化系统肿瘤组织学分级标准低分化癌19例、中分化癌29例及高分化癌12例。此外，选取其中20例患者的癌旁正常组织标本作为对照组，男性12例，女性8例；年龄37～82岁、平均(62.0±11.8)岁。

1.1.2主要试剂及仪器 第一抗体FAM96B(多克隆，ab230410)购自英国Abcam公司，TCF4(多克隆，GTX52873)购自美国GeneTex公司，第二抗体(PV-9001)试剂盒、封闭用正常山羊血清(工作液)、浓缩型二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色剂、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)及抗原修复液购自北京中杉金桥生物公司，免疫组织化学染色缸和电热恒温水浴箱购自北京永光明医疗仪器有限公司、Leica DM6B正置数字科研显微镜购自德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1EnVision二步法检测FAM96B和TCF4蛋白表达 将石蜡组织按4 μm的厚度切片，60 ℃烤箱烤片1 h，依次二甲苯脱蜡、梯度酒精下行入水；FAM96B、TCF4均用pH 6.0柠檬酸盐溶液高温高压抗原修复(FAM96B修复3 min，TCF4修复5 min)，3%过氧化氢阻断10 min，消除内源性过氧化氢酶；加10%山羊血清工作液封闭(FAM96B封闭40 min，TCF4封闭20 min)，消除非特异性染色；分别滴加FAM96B一抗(稀释度1 ∶300)、TCF4抗体(稀释度1 ∶50)；4 ℃过夜，滴加二抗37 ℃孵育15 min，DAB显色，苏木素复染，脱水封片。

1.2.2结果判断 FAM96B及TCF4蛋白细胞胞浆内黄色颗粒状着色为阳性，由2位病理医师用双盲法进行结果判定。采用200倍镜下，每张切片随机选择5个视野，每视野计数100个细胞，计算阳细胞百分比，并观察染色强度；采用免疫组织化学评分(immunohistochemical score，IHS)进行2组标本中FAM96B和TCF4蛋白阳性表达的定量评价，即先按阳性细胞所占比例<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%及>75%分别记为0、1、2、3及4分，再按着色强度未着色、浅黄色、棕黄色及棕褐色分别记为0、1、2及3分，将2者得分相乘后取5个视野的平均分记为HIS，分数越高，表示阳性越强，并将0～1分、2～4分、5～8分及9～12分分别定义为“-”、“+”、“++”及“+++”，后3个等级合并称为阳性表达[13]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 FAM96B与TCF4蛋白的表达

FAM96B表达癌旁组织的肌层、血管壁平滑肌及结肠癌肿瘤组织中的肿瘤细胞，FAM96B在对照组中的阳性表达程度最强，次之为高分化结肠癌，低分化结肠癌组织表达最弱；TCF4表达于对照组结肠黏膜腺体及结肠癌组织肿瘤细胞，对照组表达最弱，次之为高分化结肠癌，低分化结肠癌组织表达程度最强；观察组标本FAM96B蛋白的IHS评分较对照组低，TCF4蛋白的IHS评分则较对照组高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

注：A、D为对照组，B、E为高分化结肠癌组织，C、F为低分化结肠癌组织。图1 不同组织中FAM96B和TCF4蛋白的表达(EnVision，×200)Fig.1 Expression of FAM96B and TCF4 in observation group and control group(EnVision，×200)

表1 观察组和对照组组织中FAM96B与TCF4蛋白表达定量评价Tab.1 FAM96B and TCF4 protein expression in observation group and control group

2.2 FAM96B和TCF4蛋白表达与结肠癌临床病理特征的关系

免疫组化结果显示，结肠癌组织中FAM96B蛋白在未侵及浆膜层的阳性表达率高于侵及浆膜层，在低分化结肠癌组织中的阳性表达率低于中分化及高分化的结肠癌组织，差异均有统计学意义(P<0.05)；TCF4蛋白在低分化结肠癌中的阳性表达率高于中、高分化，Ⅰ～Ⅱ期中的阳性表达率低于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)。见表2。

表2 结肠癌组织中FAM96B和TCF4蛋白的表达与临床病理特征的关系Tab.2 Relationship between FAM96B and TCF4 protein expression and clinicopathological features in colon cancer

2.3 FAM96B与TCF4蛋白表达的相关性

Spearman等级相关分析显示，FAM96B蛋白表达与TCF4蛋白表达无相关性(r=0.052，P=0.692)。见表3。

表3 结肠癌组织中FAM96B与TCF4蛋白表达的相关性(n)Tab.3 Correlation of FAM96B and TCF4 protein expression in colon cancer(n)

3 讨论

结肠癌是最常见的第3种恶性肿瘤，目前的治疗方式仍不能完全有效地延缓或终止疾病的发展[14-15]。因此，积极研究结肠癌新的治疗靶点具有重要意义。FAM96B与细胞的增殖及迁移有关，与肿瘤的发生发展有密切联系[5-6,9,16]。本研究结果显示，FAM96B蛋白在观察组标本中的IHS评分较对照组低，结肠癌浸润程度越深、分化程度越低，FAM96B蛋白表达水平越低，但在不同性别、年龄、肿瘤大小及临床分期组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。这与FAM96B已知的基本生物学功能相吻合，也与Jin等[16]报道FAM96B低表达状态与前列腺癌的发生有一定关系相一致。蔡逊等[17]较早报道了过表达的FAM96B能诱导结肠癌细胞凋亡，可抑制肿瘤细胞进一步增殖。此外，国内部分研究也证实FAM96B在消化道上皮源性恶性肿瘤(胃癌及肝癌等)中呈低表达，过表达的FAM96B能抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，有望成为恶性肿瘤潜在的诊断和治疗靶点[5-6]。此外，本课题组前期研究已表明，FAM96B在胃肠道间质瘤中表达减少甚至缺失，与胃肠道间质瘤肿瘤大小及危险度分级有关[18]。本研究结果还显示FAM96B蛋白的低表达影响结肠癌肿瘤的浸润深度和病理学分型，随着FAM96B蛋白表达的减少，结肠癌肿瘤浸润深度加深和(或)病理学分化程度降低。

TCF4是Wnt通路关键条件因素之一，与细胞增殖相关[10-11]。TCF4在少突胶质细胞的终末分化和中枢神经系统髓鞘形成是必需的[19]。TCF4具有双向调节的作用，高表达可明显抑制胚胎性脑肿瘤髓母细胞瘤细胞的增殖，其表达量的多少与临床结果显著相关[20]；TCF4在原发性浆细胞样树突状细胞肿瘤中呈高表达状态，蛋白免疫组织化学染色标记TCF4为原发性浆细胞样树突状细胞肿瘤的诊断提供了一种可靠、独立及经济的方法[21]；Lydia等[22]报道了沉默TCF4可以增强结肠癌患者对常用化疗药物的敏感性，且TCF4蛋白含量越高，患者总生存期越短;Florentien等[23]证实了TCF4在急性髓系白血病中呈高表达状态，是急性髓系白血病的独立预后不良因素，可指导该病的治疗决策;Neerj等[24]研究提出TCF4蛋白过表达会导致患者发生基因突变，进而导致弥漫大B淋巴瘤形成,在弥漫大B淋巴瘤小鼠模型中，降低TCF4的表达能抑制肿瘤的生长并延长小鼠生存期，靶向抑制TCF4的表达有望治疗复发或难治性弥漫大B淋巴瘤。本研究通过检测观察组和对照组标本中TCF4蛋白的表达情况，结果表明观察组标本中TCF4的IHS评分较对照组高，说明观察组标本中TCF4蛋白表达较对照组高；分化程度越低，临床分期越高，TCF 4蛋白表达越高，但在不同性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤浸润分组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。这提示TCF4蛋白的表达与结肠癌的发生发展有关；随着TCF4蛋白表达增加，结肠癌病理组织分化程度降低或临床分期增高。

Yang等[9]报道FAM96B作为TCF4的调节基因，能调控TCF4蛋白的表达，进而在血管内皮细胞的增殖及迁移形成中发挥重要作用。本研究采用Spearman等级相关分析了观察组标本中FAM96B与TCF4蛋白表达情况的相关性，结果显示FAM96B在结肠癌组织中呈低表达，TCF4在结肠癌组织中呈高表达，但FAM96B与TCF4表达无相关性。分析可能是FAM96B与TCF4的表达水平缺乏线性关系，TCF4受多种调控因子影响等。关于FAM96B是否能调控TCF4及调控的具体机制还需进一步探究。

综上，FAM96B在结肠癌中表达减少甚至缺失，并与结肠癌浸润深度及病理组织分型有关；TCF4在结肠癌中表达增加，并与结肠癌病理组织分型及临床分期有关。提示FAM96B、TCF4与结肠癌的发生发展有关，这为临床提供了新的治疗靶点和思路。