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止血精胶囊止血活性评价及稳定性考察*

2021-04-13梅瑶关焕玉廖尚高席晓岚

贵州医科大学学报 2021年3期
关键词:白芨肝素多糖

梅瑶,关焕玉,廖尚高,席晓岚

(贵州医科大学 药学院,贵州 贵安新区 550025;国家苗药工程技术中心 &民族药与中药开发应用教育部工程研究中心,贵州 贵阳 550004)

白芨(Bletillastriata)为兰科植物白芨的干燥块茎,多年生草本,是历版《中国药典》收载的常用药之一[1-2],具有收敛止血、消肿生肌、清热利湿之功效[3-8],在临床上主要用于咯血、吐血以及外伤出血、皮肤皲裂、疮疡肿毒、肺结核吐血、溃疡病出血等病症[8-15]。白芨总提物经大孔树脂色谱柱进行组分分离后,去除了强水溶性成分和强亲脂性成分,获得的白芨的80%乙醇洗脱组分(BS-80EE)中含有大量的非多糖类化合物[16]。药理学研究发现[17-20],白芨非多糖组分能够显著缩短肝素化的小鼠凝血时间(bleeding time,BT)和出血时间(clotting time,CT);可刺激大鼠血小板活化,增强血小板聚集;可作用于凝血纤溶系统,加速血液凝固,抑制纤维蛋白降解;同时使血液黏度增加,血流速度变慢发挥止血作用。白芨非多糖组分化学成分丰富,且止血疗效显著。为了进一步开拓白芨非多糖的应用,本课题组在前期研究中,通过湿法制粒,将白芨非多糖和辅料微晶纤维素以1 ∶1比例制成颗粒后,装入胶囊壳制得止血精胶囊,该制剂和白芨非多糖粉末相比,降低了白芨非多糖粉末的吸潮性,进而也提高了白芨非多糖的稳定性。然而,止血精胶囊的止血活性仍未进行考察和验证,且在生产、贮存与使用期间过程中的稳定性也未行考察。因此,本文以小鼠全身肝素化的BT和CT作为指标,比较白芨粗提物与白芨非多糖止血精胶囊的止血疗效,并参照2015版《中国药典》四部通则9001原料药物与制剂稳定性试验指导原则[21],以水分、性状、崩解时限及含量测定等为指标,对该制剂进行稳定性考察。

1 资料与方法

1.1 药品、动物、仪器

1.1.1药品 止血精胶囊(实验室自制)、militarine对照品(批号DST-190219-100,成都德思特生物技术有限公司)、云南白药(YNBY,批号ZLA1736 20181210,云南白药集团股份有限公司)、肝素钠注射液(批号1113H0212,江苏万邦生化医药股份有限公司),乙酸乙酯、氯仿、硫酸均为分析纯,甲醇为色谱纯,水为屈臣氏水。

1.1.2动物 清洁级昆明小鼠共180只,雌雄各半,体质量18~22 g,购于长沙市天勤生物技术有限公司 ,许可证号SCXK(湘)2019-0005。实验期间动物均饲养于同一环境下,保持室温18~24 ℃,环境安静,动物随意进食进水,明暗12 h循环饲养。所有动物于试验前24 h禁食不禁水。

1.1.3仪器 十万级AE2401型电子天平(梅特勒,托利多仪器上海有限公司)、CX250型超声波清洗机(北京医疗设备二厂)、SC082767型实验室专用纯水机(四川沃特水处理设备有限公司)、DZF-6050真空干燥箱(上海博讯有限公司医疗设备厂)、ZB-1d型升降崩解仪(南京温诺仪器有限公司)、Aglient 1260型高效液相色谱仪、药品稳定试验箱(上海三腾仪器有限公司)、HT-D40型恒温箱(深圳市宇泰试验设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1白芨粗提物的提取 白芨块茎经粉碎机打成粉末,称取白芨粉末2 kg,按料液比分别为1 ∶10、1 ∶8、1 ∶8的比例加入蒸馏水,煎煮提取3次,1 h/次,合并3次提取液,过滤,浓缩至浸膏,55 ℃真空干燥得白芨粗提物29.41 g,提取率为6.8%。

1.2.2止血精胶囊的制备 白芨块茎经粉碎机打成粉末(过4号筛),按料液比1 ∶4的比例加入95%乙醇回流提取,2 h/次,提取3次。合并3次滤液后浓缩至浸膏,浸膏用水溶解后上大孔树脂D101柱色谱(树脂6 cm,75 cm),经水洗脱后,用80%乙醇溶液洗脱,收集并合并80%乙醇洗脱液,浓缩至稠膏,55 ℃真空干燥,制得白芨非多糖浸膏粉,浸膏粉(过60目筛)与稀释剂微晶纤维素按1 ∶1混匀,加入一定量的75%乙醇作为润湿剂(喷洒加入、少量多次)制软材直至“手握成团、触之即散”。过20目筛挤压制粒,将湿颗粒于60 ℃下干燥,取干燥好的颗粒整粒,过40~80目筛,去除细粉,即得粒度介于40~80目的胶囊填充物,装入3号空心胶囊,即得止血精胶囊。

1.2.3止血精胶囊止血活性考察 (1)全身肝素化小鼠CT的测定。取健康昆明小鼠90只,雌雄各半,随机分为9组(每组10只),为空白对照组、云南白药组(0.667 g/kg)、肝素钠模型组(70 U/kg)、白芨粗提物低、中、高剂量组(按生药量计为2.5、5.0和10.0 g/kg)和止血精胶囊低、中、高剂量组(按生药量计为2.5、5.0和10.0 g/kg)。各组小鼠每天灌胃给药1次,空白组和模型组分别按20 mL/kg剂量给予蒸馏水,其余各组均给予相应剂量的药物,连续给药5 d;末次灌胃给药60 min后,除空白组外其余各组均尾静脉注射肝素钠(70 U/kg),15 min后用手术刀于距小鼠尾尖0.5 cm处割断,待血液自行溢出时开始计时,每隔30 s用滤纸吸去血滴1次,直至血液自然停止(滤纸吸时无血迹)。以人工形成创面出血到出血停止所经时间计为小鼠CT。(2)全身肝素化小鼠BT的测定。取健康昆明小鼠90只(雌雄各半),随机分为10组,每组10只,分组及给药方法同“全身肝素华小鼠CT的测定”;于第5天灌胃给药60 min后,除空白组外其余各组均尾静脉注射肝素钠(70 U/kg),15 min后用眼科弯镊迅速摘去一侧眼球即有血液流出 ,于载玻片上滴 1滴血(血滴直径约 5 mm)后立即记时,每隔30 s用清洁大头针自血滴边缘由外向内轻轻挑动 1次,并观察有无血丝挑起,从采血开始至挑起血丝止,记录所用时间即为BT。

1.2.4止血精胶囊稳定性考察 (1)高温试验:取自制胶囊样品内容物适量,置于洁净的培养皿中,置于60 ℃恒温培养箱中放至第5天和第10天取样,按《中国药典》2015版四部通则9001法规中规定检测重点检查项目,与0天测定结果比较;如果样品含量下降5%,则需要在40 ℃条件下同法进行试验。(2)高湿试验:取自制胶囊样品内容物适量于洁净的培养皿中,置于温度为25 ℃、湿度为(75±5)%恒温培养箱中,放置5 d和10 d后取样,按相关要求按相关要求对胶囊外观性状、水分、崩解时限、白芨苷含量及薄层进行检测。(3)强光照射试验:取自制胶囊样品内容物适量置于光照为(4 500±500) lx的光照箱中,分别在第5天和第10天取样测定。(4)加速试验:随机抽取3批自制止血精胶囊,分别用铝箔纸包裹严密,置于温度为(40±2)℃、相对湿度为(75± 5)%的恒温培养箱中,分别于第3个月、第6个月取样1次,按止血精胶囊稳定性重点考察项目,以水分、性状、崩解时限、白及苷含量及薄层为指标进行测定。

1.2.5白芨苷含量的测定 (1)色谱条件:Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×150 nm×5 μm),保护柱为Phenomenex Security Guard C18;柱温40 ℃,流动相为甲醇 ∶水(40 ∶60),检测波长为223 nm,流速1.0 mL/min,进样体积10 μL;理论塔板数以白芨苷计数应不低于5 000,白芨苷与其它色谱峰分离度>1.5。(2)对照品溶液的制备:精密称取白芨苷标准品5.09 mg,置于10 mL量瓶中,甲醇溶解定容后,制成浓度为0.509 g/L的储备溶液,取储备液2.0、1.6、1.0、0.8、0.5和0.25 mL,分别置于25 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,混匀,制得浓度为40.72、32.58、20.36、16.29、10.18和5.09 mg/L的系列对照品溶液,白芨苷检测浓度线性范围为5.09~40.72 mg/L。(3)供试品溶液的制备:称取胶囊内容物0.2 g,精密称定,置于圆底烧瓶中,加入甲醇50 mL,称定重量,加热回流处理2 h,冷却至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,过滤,精密量取续滤液5 mL转移至25 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,即得。(4)阴性样品溶液的制备:按照止血精胶囊处方比例及制备工艺,制备缺白芨非多糖组分的阴性样品溶液,按“供试品溶液的制备”方法处理,即得。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 止血精胶囊与白芨粗提物体内药效考察

小鼠尾静脉注射肝素钠注射液后,与空白组比较,模型组小鼠的CT和BT明显延长(P<0.01),说明小鼠出血模型建模成功(图1)。与模型组相比,止血精胶囊和白芨粗提物各剂量组均能明显缩短全身肝素化小鼠的CT和BT(P<0.01或P<0.05),呈剂量依赖性;止血精胶囊组小鼠的BT、CT缩短率均较白芨粗提物组高。与云南白药组比较,止血精胶囊高剂量组小鼠的BT和CT缩短(P<0.01),而白芨粗提物高剂量组小鼠的BT和CT差异无统计学意义(P>0.05);止血精胶囊低、中、高剂量组的BT和白芨粗提物低、中、高剂量组相比,缩短率分别增加了20.7%、19.7%、15.9%,而CT分别增加了11.6%、13.7%、25.2%。因此推测止血精胶囊体内止血活性优于白芨粗提物。

注:(1)与空白组比较,P<0.01;与肝素钠模型组比较,(2)P<0.05,(3)P<0.01。图1 止血精胶囊和白芨粗提物不同剂量组对全身肝素化小鼠BT、CT的影响Fig.1 Effects of different dosages of hemostatic capsules and bletilla striata extracts on BT and CT of heparinized mice

2.2 止血精胶囊稳定性考察

经稳定性试验处理后,对止血精胶囊外观性状、水分、崩解时限以及白芨苷含量进行考察。

2.2.1影响因素试验 (1)高温试验:样品经0、5、10 d高温(60 ℃)试验,3批胶囊内容物仍呈黄棕色颗粒、含水量分别为4.82%,4.75%和5.02%,均低于9.0%;崩解时限分别为5、6和6 min,崩解时间无变化(P>0.05);3批胶囊白芨苷含量分别为26.72、26.63和26.52 mg/g,含量无明显变化(P>0.05),表明胶囊在高温下稳定。(2)高湿试验:样品在温度为25 ℃、相对湿度为(75 ± 5)%的高湿度环境下进行0、5、10 d试验,3批胶囊内容物含水量分别为4.82%、4.75%和5.02%,崩解时限无明显变化(P>0.05),白芨苷含量分别为26.72、25.42和25.92 mg/g,表明胶囊在高湿下较稳定。(3)强光照射试验:样品经 0、5、10 d (4 500±500)lx 强光照,3批胶囊内容物仍均为黄棕色颗粒,含水量均低于9.0%(分别为4.90%、3.28%、2.15%),崩解时限均<30 min,符合药典对硬胶囊的规定;3胶囊白芨苷含量分别为26.459、26.508、26.526 mg/g,即白芨苷含量物无明显变化(P>0.05),表明胶囊在强光照射下稳定。

2.2.2加速试验 由表1可知,样品经6个月加速试验的考察,其性状、有关物质、含量等与0月比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明本品在常规包装时比较稳定。

表1 止血精胶囊加速试验结果Tab.1 Results of accelerating test of hemostatic capsules

3 讨论

白芨作为我国传统的生肌止血药,在临床上具有显著意义[22-23]。前期研究已发现白芨非多糖组分具有较强的止血活性,利用高压液相色谱—电喷雾—四级杆—飞行时间串联质谱(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)联用技术指认了白芨非多糖部位的12个色谱峰,发现其中的单体化合物4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside、blestroside和gymnoside I等能显著促进血小板聚集作用。白芨苷、4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside和α-isobutylmalic acid等化合物可显著缩短肝素化小鼠的CT 值[20]。为了避免白芨非多糖组分粉末的吸潮性,本课题组通过白芨非多糖组分的胶囊剂工艺制备,获得止血精胶囊,并对止血精胶囊的止血活性和稳定性进行了评价,发现止血精胶囊能够明显缩短小鼠全身肝素化的CT和BT,且止血活性强于白芨粗提物,为白芨药材及其制剂的开发利用提供一定理论基础。

在进行样品稳定性试验考察时,根据2015版中国药典四部对胶囊剂稳定性(指导原则9001),取3批市售制剂,进行10 d的影响因素试验和6个月的加速试验,除了对主要成分白芨苷薄层鉴定和含量测定外,还分别考察了外观形状、含水量以及崩解时限,均符合质量标准要求。说明在目前采用的模拟市场包装下,该产品在6个月内其内在质量和稳定性良好,这也为以后该药品的储存条件和生产条件提供了可靠的理论依据。

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