涟水县某养殖场仔猪腹泻源沙门氏菌流行病学调查及耐药性分析

刘海军，刘兵斌，左建新，左文兵，刘小娟，王礼伟，周 刚，张晨飞

（1.涟水县园园家禽养殖有限公司，江苏 淮安 223400；2.涟水县畜牧兽医站，江苏 淮安 223400；3.江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，江苏 淮安 223000）

仔猪腹泻是养殖场常见的疾病之一，主要症状为腹泻、脱水、消瘦、精神萎靡等，进一步导致发病急、死亡率高、日增重降低、出栏时间延长、饲料转化率下降、养殖成本增加等，给养殖行业带来了严重的经济损失[1]。该病主要是致病菌、肠道环境和管理之间相互作用的综合结果，根据致病菌的不同，细菌类的可以分为埃希氏大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌等；病毒类的如非洲猪瘟病毒、轮状病毒、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒等；寄生虫类的如艾美耳球虫、弓形虫等[2]。由于细菌性腹泻在规模化养猪场患病中的普遍性和重要性，为进一步了解淮安地区细菌性病原流行病学和抗生素耐药情况，本试验开展了细菌的分离鉴定及耐药性工作，希望为疾病防控、减抗禁抗、食品安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料的来源

在2021年1月1—29日期间，采集江苏淮安地区涟水县园园家禽养殖有限公司养殖场出现腹泻症状的仔猪粪便样品进行统计分析（洋三元品种）。发病仔猪主要表现为精神不振、被毛松乱、食欲不佳、黄白色水样粪便等。使用无菌棉签采集发生腹泻症状仔猪肛门周围新鲜的粪便，无菌操作后放入EP管，-20 ℃冰箱冷冻保存。

1.2 试验材料

1.2.1 试验试剂 SS琼脂培养基、MH琼脂培养基、MH液体培养基均购自上海盛思生化科技有限公司，具体制作方法参照使用说明书。无菌脱纤维兔血琼脂培养基的制备参考兽医微生物学[3]。

1.2.2 药敏纸片 选择12种抗菌药物纸片，包括红霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素、链霉素、庆大霉素、多西环素、四环素、头孢唑啉、青霉素、利福平、氧氟沙星。

1.3 细菌的富集、分离与纯化

首先将采集的仔猪腹泻样粪便进行细菌的富集培养：样品加入5 mL MH液体培养基进行37 ℃下180 r/h连续摇床培养12 h。然后采用四区划线法接种到SS琼脂培养基上进行选择性分离纯化。挑取典型单个菌落再次富集培养后划线接种到无菌脱纤维兔血琼脂培养基中，37 ℃恒温培养12 h，观察菌株溶血情况，同时接种到MH液体培养基中备用。

1.4 革兰氏染色镜检

将无菌脱纤维兔血琼脂培养基中单个菌落进行涂片、革兰氏染色、显微镜油镜下观察菌体的形状及染色特性。

1.5 细菌生化鉴定试验

将待检菌落按照伯杰氏生化鉴定手册进行生化鉴定。

1.6 耐药性试验

将鉴定后的沙门氏菌菌液使用涂布器涂匀涂布MH琼脂培养基上，3～5 min以后，待菌液全部干燥，均匀贴上3片不同的药敏制品，纸片标准参考美国临床与实验室标准化协会（CLSI）制定的药敏制品国际标准制作，试验方法参照兽医微生物学，放置温箱培养，37 ℃下培养24 h后测量抑菌圈的直径，并根据抑菌圈的大小判断对抗菌药的敏感性[4]。

1.7 腹泻发病率、沙门氏菌分离率的流行病学调查

针对猪场腹泻发病情况进行调查统计，结合后期沙门氏菌的分离鉴定，再次分析沙门氏菌感染的流行病学情况。

2 结果与分析

2.1 细菌分离纯化结果

累计采集样品120份，对样品进行富集、分离、纯化，疑似沙门氏菌在SS琼脂上长出乳白色、圆形、边缘整齐、光滑、表面有隆起、中间有针状黑点的小菌落（图1），在血琼脂培养基上生成透明溶血环（图2）；革兰氏染色、镜检结果显示，疑似沙门氏菌为无序的、无荚膜、无芽孢、革兰氏阴性短小直杆菌（图3），最终分离纯化疑似沙门氏菌86株。

图1 沙门氏菌在SS琼脂上菌落形态

图2 沙门氏菌在兔血琼脂培养基上菌落形态

图3 沙门氏菌革兰氏染色镜检结果（1 000×）

2.2 细菌生化鉴定结果

利用分离纯化后的疑似沙门氏菌进行生化鉴定，最终86株全部能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，吲哚反应阴性，MR反应阳性，VP反应阴性，柠檬酸盐反应阳性，三糖铁斜面产碱、底部产酸及产气产硫化氢，符合沙门氏菌的生化特性。最终确定分离鉴定得到86株沙门氏菌，样品分离率为71.67%（86/120）。

2.3 细菌耐药性试验结果

对86株沙门氏菌进行药敏试验，对林可霉素的耐药株数比例最高为93.02%（80/86），且对青霉素、克林霉素以及多西环素的耐药株数比例均高于80%，而对庆大霉素、氧氟沙星高度敏感，敏感株数比例高于65%，青霉素的中敏毒株数为0（0/0），见表1。

表1 12种抗菌药物对86株沙门氏菌耐药性试验结果

2.4 细菌多重耐药结果

多重耐药结果显示，86株沙门氏菌存在4～10种耐药数类型，主要集中在6、7、8、9种耐药数类型，其中耐8种抗生素的菌株比例最高为29.07%（25/86），耐4种抗生素的菌株比例最低为4.65%（4/86），见图4。

图4 分离菌株多重耐药性分析

2.5 腹泻流行病学调查结果

对该猪场的流行病学调查发现，猪场仔猪存栏数目共2 862头，在试验期29 d内，采集到样品的天数为25 d，累计取样120份，最终分离鉴定沙门氏菌86株。最终统计采集到样品天数与调查总天数比例为86.21%（25/29），仔猪群体腹泻发病率为4.19%（120/2 862），沙门氏菌分离率为3.00%（86/2 862），腹泻情况下沙门氏菌的分离率为71.67%（86/120）。

3 讨论与结论

自2018年非洲猪瘟在我国沈阳暴发以来，2019年我国生猪出栏54 419万头，同比下跌21.6%，存栏31 041万头，同比下跌27.5%，随着牧原、温氏等各大养殖集团的产能恢复，2020年生猪的市场供应会进一步增加[5]。腹泻是猪场仔猪常见的传染病之一，而猪沙门氏菌病则是由沙门氏菌引起，急性者为败血症，慢性者为坏死性肠炎，常发生于6月龄以下仔猪，特别是2～4月龄仔猪多见，一年四季均可发生，寒冷、多雨潮湿、季节交替时发病率高，养殖管理人员需要高度重视该病的流行规律。本试验累计取样120份，最终分离鉴定沙门氏菌86株，仔猪群体腹泻发病率为4.19%，腹泻情况下沙门氏菌的分离率为71.67%，而针对淮安区域关于生猪沙门氏菌流行病学的调查和药敏纸片试验研究较少，无法进行比较分析。在其他地区，李晨等[6]从贵州地区7个养殖场128份仔猪肠道样本中发现沙门氏菌的分离率为16.41%（21/128），因为研究方法与本试验不同，导致分离率存在较大差异；曲歌等[7]在吉林地区21家规模化猪场117份仔猪腹泻粪便样本中进行PCR检测，分离出沙门氏菌19份，其中15份具有致病性，致病性高达78.95%，这进一步说明了不同地区沙门氏菌较高的致病性。在细菌的耐药性试验上，马梓承等[8]在山东泰安市某自繁自养猪场研究发现分离的沙门氏菌对庆大霉素具有耐药性、对左旋氧氟沙星高度敏感，研究结果与本次试验结果不同，还需要进一步研究。

鉴于沙门氏菌在自然界的普遍性与致病性，对畜禽健康、人类公共安全、食品安全都有严重的影响，因此在猪沙门氏菌病的防控措施上，疫苗依旧是防控疫病最重要的手段。王伟[9]建议制定合理的疫苗免疫方案，提前免疫接种猪沙门氏菌疫苗，如国内普遍使用的C500株沙门氏菌弱毒苗，在妊娠母猪、仔猪特定阶段进行首免、二免等。而除了疫苗的预防外，利用呋喃类、磺胺类和喹诺酮类抗生素，如利用诺氟沙星，配合选用大蒜进行混合饲喂治疗，连续使用25～50 g/（头·d），具有较好的治愈效果[10]。杨树皎[11]发现由于临床上沙门氏菌极易产生耐药性，故不建议采用抗生素低剂量长期预防用药，可以采用免疫增效剂或者添加倍量的维生素进行预防，利用止痢舒（主要成分：雄黄、藿香、滑石、苦参等）混饲治疗，从生物学角度进行防控。另外，需要加强畜禽饲料、饮水的质量管理，食槽、圈舍、水嘴等设备设施的清洗消毒，严格执行养殖企业的各项管理规则制度，提高管理人员和饲养人员的生物安全意识[12]。

本次研究发现涟水县某猪场仔猪沙门氏菌导致腹泻的发病率为3.00%，致病菌样品中沙门氏菌的分离率为71.67%。分离鉴定的沙门氏菌对青霉素、林可霉素、克林霉素以及多西环素的耐药株数比例高达80%，而对庆大霉素、氧氟沙星的敏感株数比例高达65%，同时耐8种抗生素的菌株比例最高为29.07%（25/86），此研究结果对沙门氏菌病绿色、安全、高效的防治提供一定参考。