金桑颗粒的质量标准研究

李德林，任路路，李小伟，韩双

作者单位：太和县中医院中药制剂室，安徽 阜阳236600

小儿外感发热常见于急性上下呼吸道感染、肺炎、支气管炎等疾病，是儿科最常见的疾病。故深入研究有效治疗小儿外感发热的药物尤为重要。目前国内外治疗小儿外感发热主要以合成药物为主，虽有肯定的临床疗效，但只是对症治疗，无病因性的治疗作用，使其临床应用受到极大限制。因此，寻找有效、新型、低毒的治疗小儿外感发热药十分必要。近年来现代基础及临床研究表明中医药在治疗小儿外感发热上不仅疗效显著，且毒副作用小，适合长期服用。

金桑颗粒处方系太和县中医院名老中医依据清代医学名家吴鞠通温病理论，采取辨病与辩证的方法，对桑菊饮、银翘散、清营汤等经典方剂进行化裁，并结合多年临床经验及幼儿发病特点，针对小儿外感发热、咳嗽所总结的经验方。本处方由金银花、水牛角、桑叶、黄芩、连翘等十味药配伍组合而成。方中金银花疏散风热，清热解毒，用于各种热病；水牛角清热凉血，解毒定惊，以上二药，共为君药。桑叶清上焦风热，善走肺络，宣肺热而止咳嗽；连翘气味芳香，既能疏散风热、清热解毒，又可辟秽化浊；黄芩清热燥湿，善清上焦之火；荆芥解表散邪，配入辛凉解表药中，增强辛散透表之力，是为去性取用之法，四药合用，助君药发散表邪，透邪外出，俱为臣药。蝉蜕既疏散肺经风热而利咽透疹止痒，又长于疏散肝经风热而凉肝息风止痉；白茅根清肺胃热而利尿，又能凉血止血；热易伤津，玄参滋阴降火解毒，淡豆豉解表除烦，上述四药为佐药。诸药合用有止咳化痰兼疏风清热之功。临床常用于小儿外感疾病如感冒、慢性肺炎或支气管炎引发的发热、咳嗽等。该方原以汤剂形式在本院应用十余年，临床疗效显著且安全可靠。为更好地发挥其疗效，便于病人服用及携带，本研究在前期工作的基础上，开发了金桑颗粒制剂。然而尚缺乏有效的质量控制方法，故为了更好的保证制剂质量及临床用药的安全性和有效性，2016年1—5月，本研究采用TLC 法对方中连翘及黄芩进行定性鉴别研究，同时采用HPLC 法对金桑颗粒中黄芩苷含量进行测定。该法操作简便、专属性强、稳定性及重复性良好，可有效控制金桑颗粒的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

XSE105DU型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多）；Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（赛默飞）；ZF-2 型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；聚酰胺薄膜（国药集团化学试剂有限公司）；硅胶G板（青岛海洋化工厂分厂）；DHG-9055A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）等。

1.2 试药

黄芩苷对照品（批号110715-201317，供含量测定用）及连翘对照药材（批号20908-201216，供薄层鉴别用）均来自中国食品药品检定研究院；金桑颗粒（批次20160328，20160329，20160330）、金桑颗粒缺连翘阴性样品（批次20160412）、金桑颗粒缺黄芩阴性样品（批次20160413），均为太和县中医院制剂室自制；甲醇为色谱纯，水为纯化水，乙醇、乙酸乙酯及甲酸等其他试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 连翘的薄层色谱鉴别

取金桑颗粒样品10 g，研细，加乙醇30 mL，超声30 min，滤过，滤液浓缩至l mL，加中性氧化铝l g，在水浴上拌匀，干燥，加在中性氧化铝柱（100～200 目，2 g，内径为15 mm）上，加无水乙醇50 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加无水乙醇l mL 使溶解，即得供试品溶液。另取连翘对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再按金桑颗粒制备工艺生产不含连翘的样品，同法制得缺连翘阴性对照溶液。照TLC 法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述对照药材溶液5 μL、三批供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（9∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛乙醇溶液与硫酸的混合溶液（18∶1），在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与连翘对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的黄褐色主斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，且阴性对照无干扰，专属性较好，三批金桑颗粒均检出连翘。

2.2 黄芩的薄层色谱鉴别

取金桑颗粒样品5 g，研细，加入甲醇50 mL，超声30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水30 mL 使溶解，用盐酸调节pH 至1.0～2.0，乙酸乙酯振摇提取2 次，每次30 mL，分取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液；另取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液；再按金桑颗粒制备工艺生产不含黄芩的样品，同法制得缺黄芩阴性对照溶液。照TLC 法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液。结果供试品溶液色谱中，在与黄芩苷对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的绿色斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，且阴性对照无干扰，专属性较好，三批金桑颗粒均检出黄芩。

3 黄芩苷HPLC含量测定

3.1 色谱条件

色谱柱为依利特Hypersil ODS2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（47∶53）；流速设置为1.0 mL/min；柱温设置为30 ℃；检测波长为280 nm；理论塔板数按黄芩苷峰计应不得低于2 500，进样量设置为5 μL。

3.2 对照品溶液的制备

称取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含22.44 μg 的黄芩苷对照品溶液，摇匀，即得。

3.3 供试品溶液的制备

取金桑颗粒约0.5 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理30 min（功率250 W，频率20 kHz），取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密移取续滤液2 mL 置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3.4 阴性对照溶液的制备

按金桑颗粒处方和制备工艺制备缺黄芩的阴性样品，再按“3.3”项下方法制备缺黄芩阴性对照溶液。

3.5 专属性试验

按“3.1”项下色谱条件，分别吸取上述供试品溶液、黄芩苷对照品溶液和阴性对照溶液各5 μL，注入液相色谱仪中，记录各自色谱图。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相同的保留时间内出现黄芩苷色谱峰，且黄芩苷分离度及拖尾因子均符合要求，而阴性对照无干扰，故该法专属性良好。见图1。

3.6 线性关系考察

取“3.2”项下的黄芩苷对照品溶液适量，置自动进样器中，分别吸取3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL于液相色谱仪中，再按上述“3.1”项下色谱条件进样，并记录峰面积。并以黄芩苷对照品进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归。结果得黄芩苷的回归方程为：Y=0.057 1 X+0.081 2（r=0.999 9），以上结果表明黄芩苷在进样量为0.067 3 mg～0.157 0 mg范围内呈现良好的线性关系。

图1 供试品和对照品HPLC图：A为黄芩苷对照品；B为金桑颗粒样品；C为阴性对照

3.7 精密度试验

取“3.2”项下黄芩苷对照品溶液适量，置自动进样器中，按“3.1”下的色谱条件，连续进样6 针，测定黄芩苷峰面积。结果黄芩苷平均峰面积为6.600，RSD 为0.28%（

n

=6），说明该仪器精密度良好。

3.8 稳定性试验

取金桑颗粒0.5 g，按“3.3”下制备方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件，将供试品溶液置于自动进样器中，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 进样测定，并记录黄芩苷峰面积，结果黄芩苷平均峰面积为6.000。RSD 为0.33%（n=8），表明金桑颗粒供试品溶液在室温放置24 h内较为稳定。

3.9 重复性试验

精密称取同一批次的金桑颗粒6份，每份约0.5 g，精密称定，按上述“3.3”项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，置于自动进样器中，再按上述“3.1”项下色谱条件进样，测定黄芩苷峰面积并计算其黄芩苷含量。结果显示6份样品的黄芩苷平均含量为9.86 mg/g，RSD为1.20%。表明该法重复性较好。

3.10 加样回收率试验

取已知含量的同一批金桑颗粒样品6份（批号：20160328）适量，分别精密加入浓度为2.891 4 mg/mL的黄芩苷对照品溶液1 mL，挥干溶剂后，按上述“3.3”项下方法制备供试品溶液，置于自动进样器中，再按上述“3.1”项下色谱条件，测定黄芩苷峰面积并计算其黄芩苷加样回收率。结果6份样品的平均回收率为96.72%，RSD 为0.35%。表明样品回收率良好，该法准确度较高。见表1。

表1 金桑颗粒黄芩苷加样回收率结果（n=6）

3.11 样品含量测定及含量限度的确定

通过投料前对处方中黄芩饮片及三批金桑颗粒样品中黄芩苷含量的测定，计算得到黄芩苷的转移率。结果表明，不同批次的黄芩饮片中黄芩苷的含量分别为13.67%、13.46%、13.08%，三批金桑颗粒中黄芩苷的含量分别为9.63mg/g、9.70 mg/g、9.70 mg/g。因处方中每1 g颗粒含黄芩饮片0.12 g，则制剂中理论每1 g含黄芩苷分别为16.40 mg、16.15 mg、15.70 mg，最低转移率为58.72%。根据2015年版《中国药典》一部规定：黄芩饮片中黄芩苷的含量不得少于8.0%（80 mg/g），则制成制剂后相当于每1g含黄芩苷不得少于9.6 mg，此工艺中黄芩苷转移率在58.72%～61.78%之间，制成制剂后最低应为：5.637～5.931 mg/g，则装量差异项下的本品每袋应为56.37～59.31 mg。结合多批制剂含量测定结果及生产实际，故本标准将黄芩苷的限度暂定为不少于每袋55.0 mg。见表2。

表2 黄芩苷含量和转移率考察结果

4 讨论

4.1 薄层鉴别

在对制剂中的连翘薄层鉴别时，曾参考相关文献，试以乙醇超声提取点样，但所含杂质多，日光下检视不清楚，故增加对提取液过大孔吸附树脂柱或中性氧化铝柱纯化过程，结果发现中性氧化铝柱分离效果更好，斑点清晰，专属性更强。此外，本研究还参考相关文献对方中其他药味如金银花、桑叶等进行了薄层鉴别研究，结果发现金银花、桑叶、淡豆豉及玄参阴性对照有干扰，荆芥及白茅根分离效果较差且斑点较不清晰，故暂未列入质量标准中，有待于进一步研究。

4.2 提取方法的优化

本研究前期曾对方中君药金银花主要成分绿原酸和木犀草苷进行含量测定，结果发现金银花阴性对照中绿原酸存在干扰，且样品中木犀草苷含量极低，故本研究选择臣药黄芩的主要成分黄芩苷作为含量测定指标，为了充分提取样品中的黄芩苷，本研究考察了超声提取和回流提取两种方法，研究结果表明二者黄芩苷含量无显著性差异，但超声提取更为简便，故选择超声提取。同时参考相关文献，考察了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇等不同比例的甲醇和超声时间20 min、30 min及40 min对提取效果的影响。结果表明以50%甲醇为溶剂，超声处理30 min，黄芩苷提取效果最佳。

4.3 流动相和色谱柱的考察

金桑颗粒为中药复方制剂，方中干扰成分较多，故流动相的优化和色谱柱的选择对样品的分离有着重要的影响。本实验考察了甲醇-水溶液及甲醇-磷酸水溶液。结果发现试验中以甲醇-水为流动相时，峰形拖尾，而加入0.1%磷酸后，拖尾现象得到改善，且分离度符合要求。此外，本研究对不同品牌的色谱柱（Thermo Syncronis C18、Wonda Cract ODS2、Hypersil ODS2）进行比较，结果发现Thermo Syncronis C18柱上黄芩苷分离度较差，Hypersil ODS2较Wonda Cract ODS2出峰时间短且分离效果较好。故本研究选择以甲醇-0.1%磷酸水溶液和Hypersil ODS2柱作为最佳流动相和色谱柱。

综上所述，本研究建立的连翘、黄芩的TLC 鉴别阴性对照无干扰、斑点清晰且专属性较强。黄芩苷的含量测定方法简便易行，重现性较好，为控制和评价金桑颗粒的质量提供科学依据。