地佐辛对坐骨神经慢性压迫性疼痛大鼠胶质细胞活性及镇痛效能的影响研究

董旭，韩学昌，邢群智，葛军蒲，闫向彪

作者单位：河南科技大学第一附属医院麻醉科，河南 洛阳471003

地佐辛是苯吗啡烷类衍生物，作为K 受体的激动剂，也是μ 受体的拮抗剂。近年被认为是一种新型的麻醉剂，其拥有不良反应低，无明显的依赖性等优点。但目前地佐辛作用于慢性压迫性疼痛（chronic constriction injury，CCI）的药理机制并未非常明确。胶质细胞具有保护神经元的功能、并为其提供营养、促进代谢、参加突触的形成。使用麻醉剂后对神经元产生的影响与其胶质细胞有着密切的关联。本研究通过对大鼠脊髓L3～4 节段胶质细胞特异性蛋白（Iba-1）和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）蛋白表达情况进行检测，探讨地佐辛对大鼠胶质细胞活性及镇定痛效能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2018年10月至2020年10月，选取雄性SD 大鼠40 只，体质量范围160～190 g，无任何头部颈部淤血等外伤。由郑州大学实验动物中心提供。动物许可证号SYXK（豫）2020－0008。大鼠自由摄食饮水，饲养温度（25.5±1.0）℃，分笼饲养。本研究符合一般动物实验伦理学原则。本研究过程严格按照国际疼痛研究协会（IASP）关于进行动物疼痛实验的纲要实施完成。采用随机数字表法将大鼠分四组，每组10只。

1.2 药品、试剂及仪器

Iba-1、GFAP一抗和羊抗兔IgG 抗体均来自美国Protein Technology 公司，ECL 发光试剂盒来自美国Thermo 公司。凝胶成像分析仪来自美国BIO-RAD。地佐辛注射液（扬子江药业集团有限公司，批准文号H20080329，批次17054565，每支1 mL/5 mg）。GFAP 抗体，美国Abcam 公司生产。VonFrey电子测痛仪、热辐射刺激仪。

1.3 实验分组

对照组不进行CCI 造模及地佐辛治疗；模型组进行CCI造模但不进行地佐辛治疗；低剂量组CCI 造模加低剂量地佐辛治疗；高剂量组CCI 造模加高剂量地佐辛治疗。于手术后即刻至术后7 d，低剂量组给予腹腔注射2.5 mg/kg 的地佐辛、高剂量组给予腹腔注射10 mg/kg 的地佐辛，低剂量组和高剂量组分别给予2.5 mg/kg、10 mg/kg 的地佐辛，稀释至5 mL 给予腹腔注射，对照组和模型组给予腹腔注射等容积的0.9%生理盐水。

1.4 大鼠CCI 模型的制作

用10%的水合氯醛4 μL/g对大鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉后，经股二头肌将大鼠的左后肢位于大腿中后部分的皮肤进行间隙钝性分离，暴露大鼠的坐骨神经干后将其与周围的软组织进行分离；定位于坐骨神经分成三股前的主干部位，大致在游离神经7 mm 左右，轻度地对坐骨神经进行结扎，最优以神经外模收到轻度的压力；强度的标准为引起小腿肌肉颤动。一共对其坐骨神经进行4 道结扎，其间距为1 mm。此时制作成CCI 模型，在手术结束之前对大鼠前肢进行肌肉注射4万单位青霉素。为保证本研究中的模型制作中尽量不出现偏差，均采取专人进行模型制作，结扎时大鼠侧肢出现轻微的抽动且术侧后爪无法承受重力，足趾开始并拢且呈轻度外翻或出现自发性缩足反射等现象为模型制作成功。对照组对大鼠的坐骨神经只进行对空气暴露，不进行神经结扎。

1.5 测定指标与方法

1.5.1

机械缩足反射阈值及热缩足反射潜伏期的测定①使用VonFrey 电子测痛仪对大鼠的病侧后足的机械疼痛阈值（Mechhanical withdral threshold，MWT）进行测量：将大鼠放置于笼内，等待30 min 使其适应环境镇定下来后使用VonFrey 电子测痛仪针尖对大鼠的病侧足后第三、四组的足底皮肤进行垂直刺激，当大鼠出现极为迅速的缩足会舔足系列动作则记为大鼠的MWT。②使用热辐射刺激仪对大鼠的热缩足反射潜伏期（Thermalpaw withdral wallatency，TWL）进行测量；使用光斑直径0.8 cm 的热辐射刺激仪按照Hargreaves 法对大鼠的足底中后处1/3 处进行照射，当大鼠出现收足、舔足、抬足甚至撕咬即认为大鼠的TWL。

对建模后大鼠第1 d、第3 d、第5 d、第7 d 的MWT、TWL进行测定及比较，间隔3分钟进行1次测定，将切断时间设置为20 s。

1.5.2

Western blotting 检测大鼠L3～4 节段脊髓Iba-1、GFAP 蛋白表达水平 对大鼠的MWT 及TWL结束测量后，使用10%水合氯醛（400 mg/kg）对大鼠进行腹腔注射麻醉后快速断头，使其冰浴的同时迅速取其L3～4节段脊髓，用液氮进行保存，加入含有磷酸蛋白酶抑制剂的SDS 缓冲液（按每毫克组织10 mL/mg 标准）和蛋白酶，将样品用沸水浴5 min后进行BCA 法测定蛋白浓度，应用湿转膜法将等量采用电泳的蛋白样品10%SDS-聚丙烯酰胺转移到PVDF 膜。用5%的脱脂牛奶进行60 min 的封闭后在4 ℃分别用1∶200的一抗Iba-1及1∶2 000的GFAP在摇床孵育过夜。洗膜后用ECL 发光试剂盒在凝胶成像分析仪处理。用Image Lab 软件条带的平均灰度值代表GFAP蛋白表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠脊髓中Iba

-

1 及GFAP 的表达水平

单因素方差分析，各指标整体差异有统计学意义（

P

＜0.05）。多重比较并结合主要数据分析：大鼠脊髓中Iba-1 及GFAP 的表达水平模型组蛋白表达水平最高，对照组水平最低。对照组与模型组，低、高剂量组与模型组的Iba-1、GFAP 表达水平，均差异有统计学意义（均

P

＜0.05），见表1，图1。

表1 各组大鼠脊髓中中Iba-1及GFA的表达水平比较/±s

图1 Western blotting检测各组大鼠脊髓Iba-1、GFAP的蛋白表达电泳图

2.2 各组大鼠疼痛行为学检测结果

整体比较（两因素重复测量方差分析）知：各指标组间差异、时间差异及交互作用均差异有统计学意义（

P

＜0.05）。两两精细比较：低剂量组、高剂量组在CCI造模后不同时间段出现了行走时抬足、跛行、足外翻等行为学变化，MWT 和TWL 均明显下降（

P

＜0.05）；与模型组相较，低剂量组和高剂量组在接受地佐辛治疗后行为学变化有缓解，MWT 和TWL 回升（

P

＜0.05），高剂量组同时间点TWL 高于低剂量组（

P

＜0.05），而两组同时间点MWT差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠疼痛行为学检测结果（n=10）/±s

3 讨论

神经性疼痛（Neuropathic pain，NPP）是一种当感觉神经系统受到损伤或者发生疾病时对躯体直接发生的疼痛。表现为痛觉过敏、感觉异常、自发性疼痛、异常疼痛等。胶质细胞是一种支持细胞，分布于中枢和周围神经系统，支持并引导神经元迁移，对整个神经系统的修复和再生进行参与，并且参与机体的免疫应答，在形成髓鞘、血脑屏障、物质代谢及维持细胞外钾离子的浓度等方面进行作用。胶质细胞与神经元的关系在神经生物学科成为最新热点，神经元在大脑中承担着重要作用，参与释放递质等影响突触活动。近年来大量的研究证实胶质细胞与NPP 有关。王伍超等研究显示，胶质细胞在活化后会对神经炎症及免疫反应进行主导，而神经炎症和免疫反应在NPP 的发生和维持上发挥着重要作用，发生神经损伤后的胶质细胞神经外周到中枢释放出细胞因子及炎性因子加速NPP 发生，因此调控胶质细胞活性或许是研究NPP的新方向。

地佐辛是阿片受体混合激动-拮抗剂，具有优越的镇痛作用。其成瘾性较小、对呼吸抑制作用较弱，在人体内吸收快、分布快，因此镇痛起效快、镇痛久等优点。临床上将其广泛在术后镇痛、全麻诱导等方面运用。Welch 等研究在大鼠上建立CCI 模型后给予吗啡会升高大鼠在术后的MWT，以此来推测地佐辛是否会有类似作用。而鲍杨等的研究结果显示，术后切口痛大鼠给予地佐辛能明显升高痛阈，认为地佐辛对术后切口痛具有明显的镇痛作用。而本研究中大鼠在建模后的MWT、TWL水平均较低，在两种不同剂量地佐辛干预下的MWT、TWL均呈现出一定水平的升高，与Welch等及李海鸥的研究结论类似，提示地佐辛对疼痛及神经反射有着抑制作用，且还发现高剂量和低剂量对升高MWT、TWL水平均有效果，但两种剂量对MWT影响间的差异并无统计学意义，高剂量的地佐辛可能并不能提高对坐骨神经压迫性疼痛的抑制作用。Iba-1为胶质细胞特异性蛋白，其阳性蛋白水平可以作为胶质细胞的标志蛋白之一；GFAP是胶质细胞的标志蛋白及主要骨架成分。GFAP 可以在一定程度上反映胶质细胞活化的状态，因此可以检测GFAP 水平来对胶质细胞进行监测。本研究结果显示，对照组GFAP 荧光强度值高于模型组、低剂量组及高剂量组，表明地佐辛可抑制大鼠脊髓胶质细胞GFAP 的表达。同时，随着地佐辛剂量的增加，GFAP荧光强度值开始降低，地佐辛发挥镇痛作用可能与抑制胶质细胞的活化有关联。

综上所述，本研究推测地佐辛在镇痛的同时又可抑制脊髓胶质细胞的活化：抑制大鼠脊髓胶质细胞活性以至下调GFAP 的表达，但由于NPP 的发病机制复杂，应扩大大鼠数量进行多中心合作以此探索地佐辛在治疗NPP的机制及临床效果。