MPO-ANCA相关性血管炎患者中性粒细胞外捕网与滤泡辅助T细胞间关系的探讨

李 霂，潘梦璐，郑美娟，帅宗文

抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)相关性血管炎(ANCA associate vasculitis, AAV)临床常分为显微镜下多血管炎(microscopic polyangitis, MPA)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(eosinophilic granulomatous polyangiitis, EGPA)和肉芽肿性多血管炎(granulomatous polyangiitis, GPA)，MPA和EGPA中ANCA识别的主要自身抗原为髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)，GPA中ANCA主要识别蛋白酶-3(protease 3, PR3)，分别称为MPO-ANCA和PR3-ANCA。在中国，AAV主要以MPO-ANCA阳性的MPA最为多见，中老年人群高发，病程进展快，病死率高。MPO-AAV的确切发病机制未明，研究表明，MPO-ANCA是致病自身抗体。B细胞发育成熟为分泌自身抗体(MPO-ANCA)浆细胞的过程中，必需CD4的滤泡辅助T细胞(follicular helper T cells, Tfh)协助，Tfh表达有CXC趋化因子受体5(CXC-chemokine receptor 5，CXCR5)和可诱导的共刺激因子(inducible co-stimulator，ICOS)，分别是Tfh的标志分子和处于活化状态的标志，前期研究显示，MPO-AAV患者周围血MPO-ANCA水平与CD4T细胞中Tfh%及其活性程度呈正相关。

中性粒细胞外捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是由激活的中性粒细胞释放的一种由去致密DNA和蛋白(其中包括MPO和PR3)构成的网状结构，基本功能之一是胞外捕获并杀灭病原体。进一步研究表明NET有促进炎症反应作用，与多种自身免疫病的发病有关。已有的研究表明，含有MPO的NET可能参与MPO-AAV的发病。然而，NET是固有免疫参与者，MPO-ANCA是适应性免疫的产物，NET如何干预MPO-ANCA产生，目前尚未见临床研究报道。该研究初步探索NET影响MPO-ANCA的可能机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料

35例MPO-AAV患者选自2018年3月—2019年10月在安徽医科大学第一附属医院住院的患者，均符合 2012 年 Chapel Hill 共识会议和1990年美国风湿病学院关于 MPA、GPA 或EGPA 的定义和分类诊断标准。间接免疫荧光法(IIF)检测核周型ANCA(p-ANCA)阳性，免疫斑点法和ELISA法检测MPO-ANCA均阳性。除外抗蛋白酶3抗体(PR3-ANCA)和抗核抗体(anti-nuclearantibody，ANA)阳性者，以免其对研究观察指标的影响。所有患者均为初次确诊，病情处于活动期，未曾接受过激素及免疫抑制剂治疗。采用修订的伯明翰血管炎活动度评分(BVAS-V3)评估每例患者的病情活动度。35例健康对照者随机选自该院健康体检中心，年龄和性别与入组病例匹配，排除结缔组织病史及近期感染性疾病史。研究符合安徽医科大学第一附属医院伦理委员会制定的关于人体试验的伦理学标准(批文号：PJ 2014-07-10)，所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂与仪器

淋巴细胞分离液(北京Solarbio公司)；FITC标记小鼠抗人CD278抗体(美国eBioscience公司)；PerCP-CyTM5.5标记小鼠抗人CD4抗体、APC标记小鼠抗人CD185抗体、PE标记小鼠抗人CD279抗体、PE-IgG1-к、APC- IgG2b-к(美国BD公司)；FITC-IgG1-к(美国eBioscience公司)；欧蒙医学实验诊断试剂盒、人MPO抗原(美国Sigma-Aldrich公司)；羊抗人IgG(美国Sigma公司)；IL-23检测试剂盒(美国BioTSZ公司)；低速离心机(Centrifuge5810R，德国Eppendorf公司)；酶标仪(PRA ELX800，美国莱姆德公司)；流式细胞仪(FACS Calibur型，美国BD公司)。

1.3 研究方法

1.3.1

流式细胞术(FCM)检测外周血Tfh 外周血单个核细胞(PBMCs)的制备：取1 ml抗凝血与1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)等体积混匀稀释；取1 ml淋巴细胞分离液于15 ml离心管内，将制备的混合液轻注入淋巴细胞分离液表面；1 260 r/min离心20 min后分为4层(从上至下依次为血浆层、PBMCs层、淋巴细胞分离液层及红细胞层)，取PBMCs层，加入3 ml PBS充分混匀，1 500 r/min离心5 min×3次，加入300 μl PBS 重悬。抗体标记及检测：取PBMCs悬液100 μl于流式管中，加入CD4-PerCP-CyTM5.5、CD185-APC、CD278-FITC和CD279-PE各5 μl，每管均设置同型对照(加入细胞悬液100 μl及FITC-IgG1-κ、PE-IgG1-κ和APC-IgG2b-κ各5 μl，振荡后避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min离心弃上清液，加入300 μl PBS重悬，上机检测。

1.3.3

IL-23检测 采用IL-23检测试剂盒，按试剂盒说明书常规ELISA步骤定量检测IL-23。

2 结果

2.1 入组患者及研究对照的临床资料

研究中入选的35例患者病程为0.5～24(5.2±6.1)月，均为初诊未治疗的患者，BVAS评分为5～47(19.2±7.3)分，病情均处于活动期。病例组与对照组间年龄分别为23～85(66.0±12.2)岁和28～78(63.5±11.9)岁，男 ∶女分别为16 ∶19和17 ∶18，组间年龄和性别构成差异无统计学意义(分别为

t

=0.862，

P

=0.392；χ=0.057，

P

=0.811)。患者组中33例临床诊断符合MPA，2例符合GPA，患者的人口学特点及AAV疾病构成符合中国MPO-AAV的特点。

2.2 研究指标的组间比较

FCM检测结果显示，与健康对照组比较，入组患者CD4T细胞中Tfh分数(Tfh%)、ICOSTfh占CD4T细胞分数(ICOSTfh%)及ICOS的平均荧光表达强度(mean fluorescence intensity，MFI)均高于对照组。ELISA检测结果显示病例组周围血NET及IL-23表达水平高于对照组。见表1。

表1 病例组与对照组各观察指标检测结果比较

2.3 病例组中各观察指标的相关性分析结果

2.3.1

MPO-ANCA与Tfh指标的相关性分析 双变量相关分析结果显示，患者周围血MPO-ANCA水平分别与Tfh%及Tfh表达ICOS的MFI(表示Tfh的活动强度)呈正相关，但多元线性回归分析结果显示MPO-ANCA水平仅与Tfh%呈正相关。见表2。分析Tfh%与患者主要内脏损害(肾和肺)间的关系，显示Tfh%与肾和肺损害BVAS间无相关性(分别为

r

=0.306，

P

=0.074；

r

=0.292，

P

=0.089)。

表2 周围血MPO-ANCA与Tfh指标相关分析结果(n=35)

2.3.2

周围血IL-23与观察指标的相关分析结果 双变量相关分析结果显示，MPO-AAV患者周围血IL-23水平分别与Tfh%、Tfh活动强度及NET呈正相关。见表3。

表3 周围血IL-23与研究观察指标的相关性分析(n=35)

2.3.3

CD4T中Tfh%与IL-23、NET的相关性分析结果 双变量分析结果显示Tfh%分别与NET和IL-23呈正相关，但多元线性回归分析结果提示Tfh%仅与NET呈正相关。见表4。分析NET与患者主要内脏损害(肾和肺)间的关系，显示NET与肾损害BVAS间存在相关性(

r

=0.390，

P

=0.021)，与肺损害间无相关性(分别为

r

=0.038，

P

=0.827)。

表4 周围血CD4+ T中Tfh%与NET及IL-23的相关分析结果(n=35)

3 讨论

淋巴组织中Tfh辅助B细胞发育成熟为分泌抗体(包括自身抗体MPO-ANCA)浆细胞的途径中，不仅可通过分泌多种细胞因子(如IL-4、IL-10和IL-21等)，还可以通过表达ICOS发挥作用。ICOS是CD28共刺激分子家族的成员，仅表达于活化的T细胞，其配体BTRP-1结构性表达于B细胞，阻断ICOS与BTRP-1的相互作用，可以抑制Tfh细胞的生成和B细胞的分化，因此，该研究选择ICOS作为Tfh活性的指标。

NET由DNA、组蛋白、MPO、PR3、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)、溶酶体膜蛋白2(lysome-associated membrane protein-2, LAMP-2)等组成。髓样树突状细胞(myeloid dendritic cells, mDC)属于专职抗原递呈细胞，动物实验研究表明，NET可能更易于被淋巴滤泡内的mDC捕获，通过向Th细胞更有效地提呈组成NET的自身抗原物质，促进自体免疫反应，产生自身抗体ANCA。IL-23是mDC活化过程产生的主要细胞因子之一，具有广泛的固有免疫和适应性免疫的促进作用，也是Tfh分化和功能作用不可或缺的细胞因子。

结果显示，与正常对照组比较，患者组周围血Tfh%、ICOSTfh%及Tfh的活动强度均增高，这与之前的研究结果一致。病例组中进一步分析Tfh各指标对致病抗体MPO-ANCA的可能影响，显示自身抗体MPO-ANCA仅分别与Tfh%及Tfh的活动强度呈正相关，但多元回归分析提示仅Tfh%是影响致病抗体MPO-ANCA的独立因素。不过，MPO-AAV患者的临床损害不仅受MPO-ANCA的影响，同时受补体旁路激活产生C5a、周围血中对抗MPO铜蓝蛋白浓度等因素影响，这可能是该研究中Tfh%与主要内脏(肾和肺)损害无相关性的原因。目前认为，NET可能是参与AAV发病的重要因素之一，研究表明患者组周围血中NET水平高于对照组，且NET与患者常见内脏损害肾损害呈正相关，支持NET可能是参与AAV发病的重要因素之一。因入组该研究的主要为高龄的MPA患者，影响肺损害评估的其他因素(如慢性支气管肺病变伴感染等)可能干预肺损害BVAS评估，出现NET与肺损害间无相关性。结果显示MPO-AAV患者周围血IL-23高于对照组，推测MPO-AAV患者分泌IL-23的mDC的活性增强。病例组中进一步分析IL-23与该研究主要观察指标间关系，发现IL-23与Tfh%、Tfh活动强度、NET分别呈正相关，符合IL-23具有促进固有免疫(NET)和适应免疫(Tfh细胞)的广泛生物学功能特点。

综上所述，Tfh%是影响致病自身抗体MPO-ANCA的独立影响因素，Tfh%分别与NET及IL-23呈正相关，经多元回归分析，结果显示仅NET是影响Tfh%的独立因素。因此，固有免疫NET参与MPO-AAV发病的可能途径之一是通过激活mDC，促进适应性免疫Tfh%升高以辅助B细胞发育成熟，产生特异性自身抗体MPO-ANCA，可能最终导致MPO-AAV发病。