低深度全基因组测序技术联合核型分析在无创产前检测高风险孕妇产前诊断中的应用

徐晶晶，胡 月，刘 文，宋雅娴，彭亚琴，何国平，吴丽敏，汪 菁

无创产前检测技术(non-invasive prenatal testing, NIPT)的推广应用有效提高了染色体非整倍体异常的检出率，降低了人口出生缺陷率。但NIPT的筛查也存在一定的局限性，既存在一定的漏筛风险，也存在一定比例NIPT结果与产前诊断染色体核型分析结果不一致的情况，这其中一个重要原因是染色体核型分析的分辨率为5～10 Mb导致染色体的微缺失微重复无法被检测到。而随着高通量测序技术的发展，低深度全基因组测序技术(low-pass whole genome sequencing，Low-pass WGS)被逐渐应用于产前诊断中，该项技术能检测到100 Kb～5 Mb间的染色体微变异，能有效弥补染色体核型分析的不足。该研究对中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)165例NIPT高风险单胎孕妇的产前诊断染色体核型分析结果和Low-pass WGS检测结果进行了回顾性研究分析，并评估了Low-pass WGS对提高无创高风险孕妇的产前诊断异常检出率的作用。

1 材料与方法

1.1 病例资料

回顾性选择2018年1月—2019年8月间因无创产前检测提示高风险来中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)进行侵入性产前诊断、并且同时进行染色体核型分析和Low-pass WGS检测的165例单胎孕妇，年龄为20～35(31.3±5.5)岁，孕周为18～28周。该研究通过该院伦理委员会批准，并且纳入研究的所有孕妇均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1

羊膜腔穿刺术 对孕妇的羊膜腔穿刺由具有产前诊断资质的医师在B超引导下进行，每个孕妇抽取3管羊水，每管10 ml，共30 ml，其中2管羊水进行细胞培养，供染色体核型分析，剩下1管羊水进行DNA提取，供Low-pass WGS检测。

1.2.2

染色体核型分析 所有孕妇的羊水样本进行两线细胞培养，每线接种10 ml羊水，培养至7 d左右进行换液，1～2 d后在显微镜下观察，根据细胞生长状态确定细胞收获时间，而后利用枸橼酸钠低渗液消化法制片、吉姆萨染色显带、最后进行核型分析。

1.2.3

Low-pass WGS检测 每例孕妇羊水中取10 ml样本送至华大基因公司完成Low-pass WGS检测，其方法如下：使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)从羊水细胞中分离基因组DNA，使用50 ng基因组DNA作为起始模板，将DNA片段化至平均大小为150～200 bp，末端修复加A后用T4连接酶加上带有特殊标签序列的接头，PCR扩增两端带有接头的DNA片段，扩增后浓度检测，每个样本取等量的DNA进行混合，取混合后总量为160 ng的DNA进行单链分离和环化反应，最终得到单链环装DNA文库，在BGISEQ-500测序仪上进行测序。测序结果使用Burrows-Wheeler Aligner(Version0.7.7)比对软件与人类参考基因组(GRCh37/hg19)进行比对、分析，并通过UCSC、ClinVar、OMIM、ISCA、Decipher、Pubmed等数据库检索，综合分析、评价所检测到的CNV致病性。

1.2.4

随访 电话随访所有纳入该研究的孕妇，对其妊娠结局及新生儿健康状况进行记录。

2 结果

2.1 无创产前检测高风险孕妇的染色体异常类型分布情况

165例孕妇中21三体高风险54例，占总例数的32.7%；18三体高风险14例，占总例数的8.5%；13三体6例，占总例数的3.6%；性染色体异常(性染色体数目偏多、偏少、片段缺失重复)64例，占总例数的38.8%；其他染色体异常(除21、18、13、性染色体外的染色体数目异常及包括21、18、13号染色体在内的片段缺失重复)27例，占总例数的16.4%。

2.2 无创产前检测高风险孕妇的染色体核型结果分析

21三体高风险孕妇中核型分析结果与NIPT一致的有44例，其中包括1例罗氏易位型21三体和1例21三体合并9号染色体倒位，阳性预测值为81.48%；18三体高风险孕妇中核型分析结果与NIPT一致的有10例，阳性预测值为71.43%；13三体高风险孕妇中核型分析结果与NIPT一致的有1例，为罗氏易位型13三体，阳性预测值为16.67%；性染色体异常高风险孕妇中核型分析结果与NIPT一致的有22例，包括：6例47, XXY；3例47, XYY；3例47, XXX；2例45, X；1例46, X, i(X)(q10)；5例性染色体嵌合核型(45, X[10]/46, XX[52]；47, XXY[6]/46, XY[62]；45, X[13]/46, X, i(X)(q10)[47]；45, X[48]/46, XY[22]；45, X[39]/46, X, i(X)(q10)[8])，2例染色体结构异常[46, XN, add(X)(p22.1)；46, XN, del(X)(p22.1)]，阳性预测值为34.38%；其他染色体异常高风险孕妇中检出6例与NIPT结果一致，包括：46, XN, -13,+mar；46, XN, del(5)(p14)；46, XN, del(1)(q42)；46, XN, del(8)(p23)；46, XN, der(4)；47, XN,+22[5]/46, XN[69]；阳性预测值为22.22%。对165例无创产前检测高风险孕妇进行核型分析共检出83例异常核型，总异常检出率为50.3%。见表1。

表1 NIPT高风险孕妇产前诊断核型分析结果

2.3 无创产前检测高风险孕妇的Low-pass WGS结果分析

对无创产前检测高风险孕妇进行产前诊断Low-pass WGS检测，21三体高风险孕妇中检出44例阳性，均为21三体；18三体高风险孕妇检出10例阳性，均为18三体；13三体高风险孕妇检出1例阳性，为13三体；性染色体异常高风险孕妇检出23例阳性，3例47, XXX；6例47, XXY；3例47, XYY；2例45, X；5例嵌合体(包括2例45, X和46, XX嵌合体；1例47, XXY和46, XY嵌合体；1例X染色体微重复嵌合体；1例Y染色体微缺失嵌合体)；3例X染色体微缺失；1例17号染色体微重复变异；其他类型染色体异常高风险检出10例阳性，1例2号染色体三体嵌合体；1例15号染色体三体嵌合体；1例16号染色体三体嵌合体；1例22号染色体三体嵌合体；6例已知致病或可疑致病性常染色体微缺失微重复变异。Low-pass WGS共检出致病性和可疑致病性变异例数88例，临床意义未明的变异(VOUS) 56例，总异常检出率为53.3%。见表2。

表2 NIPT高风险孕妇产前诊断Low-pass WGS结果

2.4 无创产前检测高风险孕妇的染色体核型结果与Low-pass WGS结果的比较

与核型分析相比，Low-pass WGS检出的21三体、18三体、13三体的例数相同，但在性染色体异常高风险孕妇中检出23例异常，在核型分析基础上额外检出1例，该病例的异常为17号染色体微重复；另有1例性染色体异常高风险孕妇两种检测结果不太一致，Low-pass WGS检测结果为45,X，核型分析结果为45,X[39]/46,X,i(X)(q10)[8]；在其他染色体异常高风险孕妇中检出10例异常，在核型分析基础上额外检出4例，分别为2号染色体三体嵌合、15号染色体三体嵌合、16号染色体三体嵌合、7号染色体微缺失。Low-pass WGS检出异常的总例数比核型分析多出5例，总检出率提高3%。见表3。核型分析与Low-pass WGS结果不一致的病例。见表4。

表3 核型分析与Low-pass WGS异常检出率差异

表4 核型分析与Low-pass WGS结果不一致病例

2.5 随访结果

对纳入该研究的165例孕妇的妊娠结局进行了电话随访。88例致病性染色体异常的孕妇中，82例孕妇已选择引产；6例孕妇在医生充分告知后选择正常分娩，其中1例为47,XN,+21，足月分娩，胎儿出生后已出现心脏异常；1例为47,XXX，足月剖宫产，胎儿出生后未见明显异常；1例为47, XYY，足月剖宫产，胎儿出生后未见明显异常；1例核型为47,XXY(6)/46,XY(62)，Low-pass WGS结果为X染色体重复嵌合11%，足月分娩，胎儿出生后未见明显异常；1例核型正常，Low-pass WGS结果为15号染色体三体嵌合体，嵌合比例为10%，足月剖宫产，胎儿出生后未见明显异常；1例核型正常，Low-pass WGS结果为46,XN,dup(17p12).seq[GRCh37/hg19](14,090,791-15,442,934)×3，足月分娩，胎儿出生后未见明显异常。

3 讨论

Lo et al研究表明孕妇外周血血浆中存在胎儿游离DNA，NIPT技术迅速发展，已在全球范围内成为一线染色体非整倍体变异筛查项目。该研究中21三体、18三体、及13三体的阳性预测值分别为81.48%、71.43%、16.67%，与以往报道基本一致。NIPT虽然对21三体、18三体和13三体的检测有较高准确性，但对其他染色体异常及染色体微缺失、微重复灵敏度不高，并且其假阳性和假阴性问题一直存在，主要原因包括限制性胎盘嵌合、双胎中一胎凋亡、母体基因组拷贝数异常、母体恶性肿瘤、母血中胎儿DNA浓度低。因此在孕妇选择该项检测时，临床医生应充分告知该技术的优势和局限性，重视其他的孕期检查以防NIPT的漏筛。

近年来，Low-pass WGS在遗传学诊断和产前诊断中的应用不断深入。《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》的发表为Low-pass WGS技术在产前诊断中的规范应用提供了指导建议。Wang et al报道了Low-pass WGS前瞻性临床研究数据，对3 429例羊水样本进行分析，Low-pass WGS与核型分析相比，可额外检出1%的明确致病性CNV。Wang et al对Low-pass WGS与芯片临床应用进行了比较分析，与芯片相比，Low-pass WGS不仅对DNA起始量要求更低，拥有更高的检测分辨率，并且对致病、可疑致病性CNV检出率提高了1.7%，技术重复率从4.6%降低到了0.5%。该中心之前的报道提示对于高龄孕妇Low-pass WGS能在核型分析基础上有效提高异常检出率。该结果显示Low-pass WGS相较于核型分析总体异常检出率更高，其中两种方法的21三体高风险、18三体高风险、13三体高风险的异常检出率相同，但对性染色体异常和其他染色体异常的检出率分别提高了1.55%和14.82%。在该研究中Low-pass WGS的优势主要体现在能检测出一些低比例嵌合体和染色体微缺失、微重复的病例。对于21、18、13三体高风险样本，在该研究中Low-pass WGS未能体现出其优势，可能原因在于一方面样本量较少(74例)，另一方面21三体、18三体、13三体高风险的样本总异常检出率较高(74.32%)。

综上所述，Low-pass WGS和核型分析联合应用于NIPT高风险人群中能有效提高染色体异常检出率，尤其是针对染色体微缺失/微重复变异和低比例嵌合体的检测，但尚不能通过该研究说明是否需对NIPT高风险中21三体、18三体、13三体高风险孕妇采用Low-pass WGS，仍需更多的临床数据结果分析进行阐明。