七氟烷全身麻醉及剖腹探查术对老年大鼠认知功能障碍机制的研究

祝亚兰，夏晓琼，王 亮，陶志国，代 镇，李美凤

术后认知功能障碍(perioperative cognitive dysfunction,POCD)是术前无精神异常的患者受围术期各种因素的影响，术后出现认知、学习、记忆、定向和精神运动行为等方面的障碍。而围术期神经认知障碍(perioperative neurocognitive disorders,PND)是Evered et al提出的一个新专业名词，是由原来的术后认知功能障碍更名而来。目前，PND的发病机制尚不清楚。大部分学者认为，术后认知功能障碍是在老年患者中枢神经系统退化的基础上，由手术和麻醉诱发，多种因素联合作用所致的神经功能减退。麻醉药物如七氟烷、异氟烷可降低自身脑功能代偿功能，导致机体缺血性代谢和病理变化，与术后认知功能障碍关系密切。

过去认为，老年患者PND的发生与脑神经元的病变密切相关，而与脑星型胶质细胞的关系不大。随着研究的深入，星型胶质细胞对PND发生发展的影响受到越来越多的关注。有研究表明全身麻醉及手术创伤可引起炎症反应，导致星型胶质细胞被激活，合成和分泌大量炎性因子，后者可诱导神经元发生凋亡，并最终参与认知功能障碍的发生。但关于七氟烷和剖腹探查术对老年大鼠认知功能障碍关于星型胶质细胞数量的研究鲜有报道，该研究是建立在剖腹探查术的动物模型基础上，探讨七氟烷全身麻醉手术后老年大鼠术后认知功能障碍与星型胶质细胞数量的关系，为临床预防以七氟烷全身麻醉类药物和剖腹探查术患者认知功能障碍的发生提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

七氟烷(20030431，上海恒瑞医药有限公司)，GFAP(MAB360，美国Millipore公司)，通用型二抗试剂盒(PV-6000，北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(ZLI-9018，北京中杉金桥生物技术有限公司)，离心机(JW3021HR，安徽嘉文仪器装备有限公司)，酶标仪(RT-6000，深圳雷杜生命科学有限公司)，麻醉气体监护仪(Infinity Kappa，德国Drager公司)。

1.2 实验动物

老年SD大鼠，普通级，16月龄，体质量400～500 g，购自安徽医科大学实验动物中心，所有实验大鼠置于通风的动物室内，保持(22.0±0.5)℃，正常饮水，维持正常的昼夜节律。

1.3 麻醉方法及分组

30只大鼠随机分为3组(

n

=10)：对照组、麻醉组、麻醉手术组。麻醉过程中维持氧流量2 L/min，大鼠置于透明玻璃箱中麻醉，在箱底铺石灰钠吸收密闭环路中的CO，监测七氟烷和呼气末CO浓度，顺次连接氧气、挥发罐、麻醉气体监护仪，对照组不做任何处理；麻醉组吸入4%七氟烷诱导，待翻正反射消失后吸入2%七氟烷持续2 h；手术组吸入4%七氟烷诱导，待翻正反射消失后吸入2%七氟烷持续2 h，同时行剖腹探查术。B、C组在翻正反射消失后迅速用16 G套管针对大鼠进行气管插管，插管成功后将大鼠固定在动物立体定位仪上，对大鼠进行机控呼吸。麻醉手术结束后，使大鼠吸入空气自然苏醒，待其可自由活动后，放回笼中，在苏醒后1 d开始进行Morris水迷宫实验。

1.4 认知功能的测试

该实验采用Morris水迷宫实验测定大鼠的空间记忆和学习记忆能力，进而分析大鼠的认知功能。实验分为两个部分：定向航行实验和空间搜索实验。定向航行实验是测量大鼠获取学习记忆的能力。实验前1周将大鼠放入池中训练，每次训练时，先将大鼠放在平台10 s，让其熟悉周边环境，然后将其头朝池壁放入水中任一象限，如果在60 s内未找到平台，则引导它找到平台，在平台待10 s。每只大鼠每天训练4次，每次训练间隔10～20 min，连续训练5 d。大鼠完成定向航行训练后，对不同组别大鼠进行相应处理干预。空间搜索实验用于测量学会寻找平台后，保持对平台空间位置记忆的能力。该实验选取大鼠在定位航行术后1、3、5 d的逃避潜伏期作为学习能力监测指标，并在空间搜索中的术后第6 天穿环次数作为空间记忆能力监测指标。

1.5 老年大鼠剖腹探查术

大鼠先用4%七氟烷麻醉诱导，根据大鼠对疼痛的反应及时追加麻醉剂量，待翻正反射消失后以2%七氟烷维持，迅速用16 G套管针对大鼠进行气管插管，插管成功后将大鼠固定在动物立体定位仪上，对大鼠进行机控呼吸。将其腹部皮肤剪去毛发，消毒后取腹正中切口约4 cm。逐步切开皮肤、皮下组织和腹膜，打开腹腔，依次探查肠道、肝、脾、肾等脏器。

1.6 ELISA检测血清GFAP浓度

所有大鼠在处死前用非抗凝真空管取尾静脉血2 ml。获取血样后迅速分离分装血清，在-20 ℃条件下冰冻储存待检。血清GFAP浓度采用ELISA法，用美国Millipore公司生产的GFAP试剂盒及配套试剂进行检测，记录GFAP浓度。

1.7 脑组织切片制备、免疫组化、扫描分析

术后第6天水迷宫结束后断头取脑。依次进行腹腔注射、0.9% NaCl溶液冲洗、多聚甲醛固定、脱水。完成后去除脑组织用OCT液常规包埋、冰冻切片。将脑组织蜡块放入切片机，行连续冠状石蜡切片，片厚5 μm，每隔5张切片取1张，切下的薄片放入温水浴箱中待烫平后贴到载玻片。切片常规二甲苯脱蜡，经100%、95%、80%乙醇脱水，放入自来水充分冲洗，直到切片干净透明。在切片冲洗的时候盛双蒸水2 L，倒入40 ml、pH8.0 EDTA修复液，电磁炉加热至沸腾，再将切片连同染色体架放入修复液中，盖上锅盖，沸腾后修复约2 min后停止，将切片连同高压锅自然冷却，不能骤冷。将孵育盒稍装一点水，将切片一张张拿出，用免疫组化笔圈住组织，放在孵育盒上，在组织上滴加3% HO室温孵育20 min，PBS冲洗3次/5 min。滴加一抗(GFAP-1 ∶500)，盖上孵育盒盖子，37 ℃孵育60 min，PBS冲洗3次/5 min。甩干，加DAB显色剂，显微镜下控制显色时间(有阳性终止显色)；自来水冲洗后，苏木精复染，水洗；1%盐水乙醇分化数秒，水洗；碳酸锂蓝化1min，水洗；脱水、透明、封片。每只大鼠选取海马CA1区切片5张作为观察对象，再随机选取一个视野，在显微镜下观察棕色为阳性表达的位置，即记录星型胶质细胞数量。

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验结果比较

2.1.1

术前水迷宫实验逃避潜伏期结果 重复测量分析结果显示，逃避潜伏期随着训练时间增加而缩短(

F

=4 484.25,

P

<0.05)，但3组间逃避潜伏期差异无统计学意义。见图1。

图1 术前3组各时间点逃避潜伏期的比较

2.1.2

术后水迷宫实验逃避潜伏期结果 重复测量分析结果显示，3组间逃避潜伏期有统计学差异(

F

=983.12，

P

<0.05)。组内比较，术后第3、5天，各组的逃避潜伏期无统计学意义，术后第3、5天与术后1 d逃避潜伏期比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)；两两比较分析显示，麻醉手术组逃避潜伏期高于麻醉组和对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)，而麻醉组逃避潜伏期高于对照组(

P

<0.05)，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图2。

图2 3组大鼠术后各时间点逃避潜伏期(s)的比较与对照组比较：*P<0.05；与麻醉组比较：#P<0.05

2.2 穿环次数的比较和星型胶质细胞数量的比较

术后第6天穿环次数3组间差异有统计学意义(

F

=82.05,

P

<0.05)，组间比较，麻醉手术组低于对照组和麻醉组，差异有统计学意义(

P

<0.05),麻醉组低于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；海马CA1区星型胶质细胞数量3组间差异有统计学意义(

F

=1 089.33,

P

<0.05),组间比较，麻醉手术组低于对照组和麻醉组，差异有统计学意义(

P

<0.05),麻醉组低于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见图3和表1。

图3 穿环次数和星型胶质细胞数量的比较A：3组间大鼠空间搜索实验穿环次数的比较；B：3组间海马区星型胶质细胞数量比较；C：海马CA1区星型胶质细胞表达(免疫组化×400)；与对照组比较：*P<0.05；与麻醉组比较：#P<0.05

表1 大鼠空间搜索实验穿环次数与海马区星型胶质细胞数量比较

2.3 处死前血清GFAP浓度比较

处死前血清GFAP浓度3组间差异有统计学意义(

F

=195.66,

P

<0.05)，组间比较，麻醉手术组GFAP浓度低于麻醉组和手术组，差异有统计学意义(

P

<0.05)；而麻醉组与对照组比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表2。

表2 大鼠血清GFAP浓度比较

2.4 空间学习记忆能力与星型胶质细胞数量及血清GFAP浓度的相关性

Pearson相关分析表明，麻醉手术组和麻醉组海马CA1区星型胶质细胞数量与术后1 d逃避潜伏期呈负相关(

r

=-0.821，

P

<0.05；

r

=-0.969，

P

<0.001)，与穿环次数呈正相关(

r

=0.919，

P

<0.001；

r

=0.896，

P

<0.001)；麻醉手术组和麻醉组血清GFAP浓度与术后1 d逃避潜伏期呈正相关(

r

=0.939，

P

<0.001；

r

=0.933，

P

<0.001)，与穿环次数呈负相关(

r

=-0.842，

P

<0.001；

r

=-0.861，

P

<0.05)；而对照组星型胶质细胞数量和血清GFAP浓度与术后1 d逃避潜伏期及穿环次数无相关性，差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表3。

表3 星型胶质细胞数量与Morris水迷宫成绩的相关性(n=10)

3 讨论

术后认知功能障碍是麻醉术后一种常见并发症，其发病机制一直以来也备受关注。老年人是术后认知功能障碍的高发人群，其脑组织生理结构和功能在此过程中发生着重大变化。Morris水迷宫试验是测试认知功能的经典试验之一，是公认的评价啮齿类动物认知功能的重要试验手段。该实验通过单纯七氟烷麻醉、七氟烷麻醉下剖腹探查术来构建模型探讨PND发病机制。Morris水迷宫实验结果表明，术前5 d进行定位航行训练，且随训练时间增加，潜伏期越来越短，表明老年大鼠存在学习能力；术后进行定位航行训练，手术组逃避潜伏期高于麻醉组和对照组(

P

<0.05)，而麻醉组逃避潜伏期高于对照组(

P

<0.05)，这表明七氟烷和剖腹探查术均可以损害老年大鼠学习记忆能力，且七氟烷麻醉加剖腹探查术造成的学习记忆能力损害更严重，提示造模成功。麻醉组和麻醉手术组的术后第1天与术后第3、5天逃避潜伏期比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)，而第3、5天逃避潜伏期差异无统计学差异，第3、5天相差不大可能是因为在术后进行重复水迷宫实验，导致大鼠具有了定位航行能力，逃避潜伏期明显短于原组中动物术后1 d的潜伏期，训练提高了大鼠的学习记忆能力，并可能改善了麻醉和手术对认知功能的抑制作用。有研究表明PND的持续时间在动物研究中有所不同，取决于年龄、物种和使用的手术技术，但大多数持续1～7 d。麻醉组和手术麻醉组对术后认知功能的损害是否是暂时的，该实验对认知功能的评定只进行了6 d，有待进一步研究。麻醉手术组术后第6天穿环次数低于麻醉组和对照组(

P

<0.05)，而麻醉组穿环次数低于对照组(

P

<0.05)，表明七氟烷麻醉和剖腹探查术损害了大鼠空间记忆能力，且七氟烷加剖腹探查术损害大鼠空间记忆功能更严重。海马神经元与学习认知功能具有显著的相关性，海马神经元的损伤可能是其发生认知功能障碍的主要原因。因此推测海马区星型胶质细胞的数量减少可能会影响神经元的功能，进而导致认知功能障碍。该研究免疫组化染色法检测海马区星型胶质细胞数量，结果显示，麻醉手术组海马CA1区星型胶质细胞数量低于对照组和麻醉组(

P

<0.05)，麻醉组低于对照组(

P

<0.05)，这表明七氟烷和手术都可以导致老年大鼠海马CA1区的星型胶质细胞减少，但是麻醉后进行手术会更加促进老年大鼠星型胶质细胞的减少，进而加重老年大鼠的认知功能障碍。挥发性麻醉药的神经毒性与大脑海马区细胞凋亡有关，七氟烷的暴露会引起星型胶质细胞形态的改变，继而引起神经元发育异常，从而导致认知功能障碍。神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星型胶质细胞的中间丝细胞骨架蛋白，也是星型胶质细胞的活化的分子标志物。星型胶质细胞激活表明神经细胞受到损伤，因此GFAP经常作为评价脑损伤的一个重要指标。全身麻醉手术后GFAP通过血脑屏障进入血液，释放谷氨酸及血管源性促细胞分裂素，星型胶质细胞激活致GFAP快速合成，含量增多。该结果显示，麻醉手术组血清GFAP浓度较麻醉和对照组升高(

P

<0.05)，而麻醉组高于对照组(

P

<0.05)，表明七氟烷麻醉和剖腹探查均可导致血清GFAP浓度升高，而麻醉加手术可致血清GFAP浓度更高，表明七氟烷麻醉和手术可加速星型胶质细胞活化，进而损伤神经元，导致认知功能障碍。

Pearson相关分析表明，麻醉手术组和麻醉组海马CA1区星型胶质细胞数量与术后1 d逃避潜伏期呈负相关，与穿环次数呈正相关；麻醉手术组和麻醉组血清GFAP浓度与术后1 d逃避潜伏期呈正相关，与穿环次数呈负相关。而对照组海马CA1区星型胶质细胞数量及血清GFAP浓度与穿环次数及术后1 d逃避潜伏期无相关性。这些结果提示海马CA1区星型胶质细胞数量减少、血清GFAP浓度升高可能与海马依赖的空间学习记忆能力损害有关。